第1章蛋白质结构与功能幻灯片.pptVIP

超速离心 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 §4.7 多肽链中氨基酸序列分析 （改进的Sanger法） 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析） 离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分 N-端反应 水解肽链的方法及特征 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、Tyr、Trp（C） 弹性蛋白酶 Ala、Gly、Ser、Val（C） 胃蛋白酶 Phe、Trp、Tyr（N） 溴化氰 Met（C） 羟胺 Asn—Gly Edman 降解法 组合对比 从核酸序列反推氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 DNA 序列分析 mRNA 序列分析 根据遗传密码反推蛋白质的序列 本章重点 概念：蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、模体、蛋白质变性、蛋白质等电点（pI） 20种氨基酸的分类 ?-螺旋的结构要点 GSH的生物学功能 蛋白质的理化性质 * * * * * * * * * * * A convenient method to quantify proteins. * A convenient method to quantify proteins. §4.3 蛋白质的变性、沉淀和凝固 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性（denaturation） 造成变性的因素 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 溶解度下降 粘度增加 结晶能力消失 易被蛋白酶水解 生物活性丧失 蛋白质变性后的理化和生物学性质改变 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 应用举例 若蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation） 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链间会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 蛋白质沉淀 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) §4.4 蛋白质的紫外吸收（280nm） 蛋白质分子在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 某研究生利用紫外分光光度法测量一个八肽分子在溶液中的含量，测量得到的OD280的值接近于0，该研究生认为溶液中不含有此八肽分子。其检测结果是否可信？为什么？(八肽序列如下：Ser-Leu-Glu-Pro-Asn-Thr-Gly-Met) §4.5 蛋白质的呈色反应 茚三酮反应 双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度 呈色反应可用于蛋白质的定性和定量分析 §4.6 蛋白质的分离和纯化 透析及超滤法 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 电泳 层析 超速离心 透析和超滤法 可清除蛋白质溶液中的小分子化合物 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 超滤法 透析(dialysis) 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 是常用的蛋白质沉淀方法 使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 盐析原理：盐离子亲水性比蛋白质强，高浓度盐夺去了保护蛋白质胶体的水化膜；同时，盐又是强电解质，能抑制弱电解质的蛋白质解离，从而使保护蛋白质胶体的电荷减少。 盐析时溶液的pH越接近蛋白质的pI，效果越好 。 分段盐析法 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 免疫沉淀法（im