基因工程操作流程-2016分解.ppt

PCR技术与DNA复制的比较 * 1. cDNA(complementary DNA):是指经反转 录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。 2. 基因组DNA（genomic DNA）：是指代 表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体 及线粒体）的所有DNA序列。 * M： DNA Marker； 1：阳性对照；2-3：转化植株； 4：空白对照；5：未转化植株 （一）原核细胞的基因结构（补） 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子--一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 终止子--也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。 能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 编码区: 非编码区: 原核细胞的基因结构 有调控作用，含启动子、终止子等。 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 （二）真核细胞的基因结构(补) 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续 不连续 编码区 非编码 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 1.2基因工程的基本操作程序 目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因, 也可以是一些具有调控作用的因子。 取 出DNA 用限制酶切断DNA 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 1. 目的基因的获取 基因文库的种类： 基因组文库：含有一种生物所有的基因 部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库） 获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因 基因文库（gene library）的概念： 将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 组织或细胞染色体DNA 限制性核酸内切酶 DNA片段 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 载体 受体菌 基因组文库 存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。 mRNA 逆转录酶 c DNA 双链cDNA 重组DNA分子 载体 含重组分子的转化菌 受体菌 用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。 cDNA文库 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子（具有启动作用的DNA片段） 无 有 基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段） 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 基因文库的作用： 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获取所需的目的基因 获取目的基因的根据：见课本P9 PCR(polymerase chain reaction) ——多聚酶链式反应 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。 获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因 PCR扩增仪 原理： 反应过程： 1. 变性：将反应系统加热至90 ℃ -95℃ ，使模板DNA完全变性成为单链； 2. 退火：将温度下降至55℃- 60℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至70℃- 75℃ ，DNA聚合酶 以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循 环后，可将模板DNA呈指数形式扩增。 反应体系： DNA双链复制 模板DNA、特异性引物（与目的基因的起始段互补）、热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）、四种脱氧核苷酸（ dNTP ）及缓冲液 前提： 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据 这一序列设计引物 利用PCR技术扩增目的基因 结果 酶 场所 解旋方式 不 同 点 条件 原料 原理 相 同 点 DNA复制 PCR技术 四种脱氧核苷酸 高温变性 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 模板、能量、酶 DNA双链复