高级生化实验讲义[精选].doc

实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用 – 16学时 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。 二.基本原理 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和基因相融合形成嵌合基因，在调控序列控制下进行表达，利用的表达产物标定目的基因的表达调控。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。 在动物基因表达调控的研究中常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光酶基因等。(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)荧光酶作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。 G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）通过与异源三聚体G蛋白的相互作用广泛参与胞内第二信使的调控，从而实现细胞外到细胞内乃至细胞核的信息流通。受体激活后，G蛋白解离为α亚基和βγ亚基并各自激活胞内信号。其中，与Gaq相偶联的GPCRs通过激活磷脂酶Cβ（PLCβ）使质膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）两个第二信使。IP3与内质网上的IP3配体结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活各类钙离子依赖蛋白。DG可活化与质膜结合的蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC），活化后的PKC通过磷酸化蛋白质的丝氨酸/苏氨酸促使细胞产生不同的反应；与Gas偶联的GPCRs通过激活腺苷酸环化酶（adenylyle cyclase，AC）产生cAMP；与Gai相偶联的GPCRs抑制AC并减弱cAMP水平。同时，来自Gai和其他G蛋白的βγ亚基可通过激活有丝分裂激活蛋白激酶mitogen-activatedprotein kinase，MAP kinase）途径从而活化一系列效应系统。 Gas偶联的GPCRs，在激动剂结合后，可造成胞内cAMP水平的升高，进而激活PKA。活化后的PKA可通过磷酸化CREB（CRE binding protein），促使CREB入核并与特定基因的CRE启动子序列结合，从而促进基因转录。促生长素抑制素somatostatin）、绒毛膜促性腺激素α-chorionic-gonadotrophin）和促肾上腺皮质素释放激素corticotrophin-releasing hormone）基因启动子中的CRE序列由TGACGTCA组成，而c-fos启动子中的CRE则由TGACGTTT组成。 抗原刺激T细胞后可激活PLC，接着PLC活化转录因子NFAT（nucler factor of activated T cells）。PLC激活后可通过水解磷酸肌醇增加肌醇磷酸和二酰基甘油的浓度，后两者分别可增加胞内钙离子水平和激活PKC，PKC可促进AP-1即刻早期基因依赖钙调蛋白的磷酸酯酶un形成转录复合物，最终协同诱导NFAT和AP-1反应元件控制下基因的表达。 血清反应元件（SRE）通过MAP激酶途径激活。SRE由血清反应因子和三元复合因子（如：Elk-1）组成。MAP激酶通过磷酸化三元复合因子而使复合物起始转录。来自于Gai的βγ亚基通过激活Ras依赖的MAP激酶激活此条途径，而通过Gaq偶