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中文4110字 出处：J Nat Med (2010) 64:182–186 用HPLC–DAD–ESI–MS/MS方法对黄芪抗病毒活性部位进行植物化学研究 Li Tang ? Ying Liu ? Yeing Wang ? Chunlin Lon 摘要：黄芪在中国是一种用来治疗疾病的常用中草药。为了弄清黄芪的抗病毒成分，我们用HPLC–DAD–ESI–MS/MS分离和鉴定了黄芪提取物的几种抗病毒的活性成分。通过比较已发表文献的保留时间和MS数据，共鉴定出18个化合物，包括11个黄酮和7个皂苷类化合物。这个研究为快速鉴别传统中药的生物活性成分提供了一种途径。 关键词：黄芪 抗病毒的 活性 黄酮 皂苷 前言： 中药广泛用于疾病的治疗，为中华民族的繁荣和发展做出了重要贡献。然而，它的治疗机制却没有弄清。现在中药的复杂成分和它的有效性相关的提法被广泛接受。因此，为了保证中药在临床上的可靠性，更好的弄清药物活性的基础并且提高产品的质量，阐明和分析中药的活性成分是很有必要的。由于中药成分的复杂性使这一领域的研究有很大挑战性。因此，鉴别有效成分是很重要的。现在，HPLC–MSn已经被证明是中药提取鉴定的一个有力工具。这个方法在灵敏度和特异性方面有优势。黄芪，是荚膜黄芪的干燥根，在中国叫做黄芪，是广为人知的一种补气药。黄芪拥有许多生物学功能，包括保肝，抗氧化，抗病毒，抗高血压和刺激免疫应答等。根据报道黄芪含有三萜皂苷，异黄酮类和多糖等类成分。在这个研究研究中，我们对黄芪的有抗炎活性的部分进行了植物化学成分的研究。采用HPLC–DAD–ESI–MS/MS 技术，比对已有化合物的UV光谱和MS数据共鉴别出18个化合物，包括11个黄酮类化合物和7个皂苷类化合物。这个结果有助于人们对黄芪的临床用药有更好的理解，并且有利于为这个传统中草药提供更好的质量控制方法。 材料和方法： 化学制品和试剂： 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,毛蕊异黄酮，7-羟基-4′-甲氧异黄酮都已经从荚膜黄芪中分离得到。标准品保存在我们实验室，结构已经经氢谱和碳谱阐明(一瓦里安Mercury-Vx BB 器材, 帕洛阿尔托, 美国, 300 MHz下测得氢谱, 75 MHz 下获得13C谱)。 通过HPLC检测纯度高于95%。黄芪甲甙IV买自国家药品生物制品检定所（北京，中华人民共和国）。HPLC用乙腈从默克公司购买。分析用乙醇和乙酸购自北京试剂有限公司。D101大孔树脂购自中国天津树脂厂。 材料和样品准备： 黄芪在2007年12月北京同仁堂中药有限公司购得并且经作者进行了形态学鉴定。植物经乙醇冷凝回流提取三次（每次两个小时）。过滤和浓缩后，干浸膏用水再次溶解并且过D101大孔树脂柱。用水和30%乙醇洗脱后用70%乙醇再次洗脱。三次提取物用旋转蒸发仪减压浓缩。和最开始的乙醇提取物一起，准备做抗病毒实验。 HPLC–MS工具和条件： 分析用安捷伦1100系列MSD Trap system（安捷伦科技，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国），此系统装备了真空除气器，四元泵，自动采样器，柱温箱，二极管阵列检测器，电喷射离子化接口的离子阱质谱仪，用安捷伦LC/MSD Trap软件控制，Zorbax SB-C18 (150 mm×4.6 mm i.d., 5μm)和 一个 Zorbax ODS-C18 预柱 (12.5 mm×4.6 mm i.d., 5μm)用来分离。流动相为水-0.3%乙酸（A）和乙腈（B）.梯度洗脱：0–30分，线性梯度20–60% B；30–35分，线性梯度60–20% B。流速0.8 ml/min，柱温25°C。峰用DAD检测器，在阳离子模式下检测。质谱在质核比100到1500范围扫描。为得到每个分析物的最大信号峰，MS条件选择如下：干燥氮气，8l/min，毛细管温度325°C，喷雾器压力30psi，毛细管电压，15 V；离子喷射电压3.5kV，待测物溶于甲醇中配制成5mg/ml溶剂，在12000 rpm条件下离心15min，在进样前去除颗粒状物。 细胞和病毒: Hep-2细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基中培养。该培养基中含2mmol/ L的谷氨酰胺，100U/ml的青霉素，链霉素，另添加10%胎牛血清(中美合资生物技术公司)。培养基放在37°C，5%CO2条件的培养箱中。副流感病毒，呼吸道合胞体病毒，单纯疱疹病毒-1，单纯疱疹病毒-2，腺病毒-3和腺病毒-7由中国中药研究所，中药研究会提供。病毒在单层Hep-2细胞中繁殖并储存在-70°C的冰箱中。 体外测定抗病毒活性： 被测成分用DMSO溶解并浓缩到10mg/ml。工作溶液通过用MEM双重连续稀释的方法准备好并加入到四个孔中，200μl/well 。正常细胞做对照。四天