干细胞常用实!验技术protocol.docVIP

实验室内部的人胚胎干细胞protocol 人类胚胎干细胞H1和H9维持方案一、试剂配制饲养层细胞培养基Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM)DMEM (GIBCO 11960-044) 450ml FCS GIBCO 16000-044 50ml 10%Pen/Strep 2.5ml 50IU/mlL-glut GIBCO 25030-081 5ml 2uM/ml人类胚胎干细胞培养基HESC-MediaKO-DMED GIBCO 10829-018 480ml KOSR GIBCO 10828-028 120ml 20%10mM NEAA GIBCO 11140-050 6ml 0.1mML-glut(0.2M) GIBCO 25030-081 6ml 2mMPen/Strep 3ml 55mM BME GIBCO 21985-023 1.1ml 0.1mMITS GIBCO 41400-045 6ml 4-80C避光保存。用前每50毫升加200-400ng bFGF细胞冻存培养基FBS-DMSOFCS GIBCO 16000-044 9ml 90%DMSO SIGMA D2650 1ml 10%细胞消化液 Trypsin-EDTA0.25% Trysin-1mM EDTA GIBCO 25200-056 2ml 0.05%,0.2mMPBS(-) 14190-144 8ml MEF细胞有丝分裂终止液 Mito CMitomycin C 0.2mg 0.05mg/mldd-H2O 15230-162 4ml 避光保存。Mito C的终浓度为10ug/ml即40吸ul 工作液加到 2ml F-DMEM中。.0.1% Gelatin(用于培养皿的包被)1% Gelatin 40ml 0.1%ddH2O GIBCO 15230-162 360ml 高压消毒。二、 培养方案一) 饲养层细胞的培养1、主要实验材料（1）培养液为F-DMEM。（2）小鼠 周龄为7～8w的性成熟母小鼠和周龄为8w的种公鼠。2. 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养（1）小鼠胚胎的准备1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。2)每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。3)取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PBS或无血清DMEM平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。（2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养二) 培养方法有两种: 组织块培养法和单细胞悬液培养法。组织块培养法：1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下 的碎块,吸置于离心管内。 2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。3) 向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。4) 加入等体积的培养液终止消化。室温下静止5-10min。5) 弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。6） 加入 5ml培养液重新悬浮鼠胚组织块,移入培养瓶内。每5个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶