【2017年整理】细胞培养注意事项.docVIP

动物种质资源体细胞采集、培养、保存规程(讨论稿) 本规程适用于动物种质资源体细胞采集、培养、保存及其相关操作。由于细胞培养技术内容非常丰富，本规程仅对其中最主要的部分做了基本的规范。在实际操作过程中，在此规程的基础上，一些实验技术的细节，还需参照相关的权威性的参考书，并根据本实验室的具体情况加以灵活运用。 培养室内的无菌操作 细胞培养实验所需的物品、器材应进行严格的灭菌或购买无菌的一次性物品。玻璃瓶可拧松瓶盖灭菌（指高压蒸汽灭菌，以下同）或用铝箔纸包住瓶口，和瓶盖分别灭菌。其它玻璃和金属器材用铝箔纸包裹进行灭菌。玻璃吸管应塞上棉花球灭菌，然后置于烘箱中烘干。不适于进行高压灭菌的瓶塞等其它物品，可浸泡在70%酒精中进行灭菌，然后在超净工作台上吹干。细胞培养液和其它不适于高压灭菌的溶液，应通过过滤（采用0.22μm的孔径的滤膜）灭菌。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖地面一次，并用紫外线照射灭菌30分钟。超净工作台每次使用前用70%酒精擦拭，然后紫外线照射30分钟。 进入无菌操作室要求穿着无菌工作服、工作帽、口罩。开始工作前用70%酒精对手、前臂及乳胶手套进行消毒。细胞培养等操作应在超净工作台或有空气过滤器的空间内进行。操作前点燃酒精灯，细胞培养的所有操作，如打开或关上试管或培养瓶盖等，都要靠近酒精灯并经过短时间的灼烧。烧过的实验器械，冷却后才能使用。已吸过培养液或其它有机液体的吸管不得再用火焰烧灼。不同液体分别用不同的吸管吸取，不能混用。开盖后的培养瓶尽量避免垂直放置，同时瓶盖应扣放在超净工作台上，以减少落入细菌的机会。细胞培养物在处理和使用前，不要过早暴露于空气中。在进行转移液体操作时，移液器不能触及瓶口以避免细菌污染或交叉污染。放置吸管时管口向下倾斜，以防止液体倒流引起污染。培养细胞的废弃用品，应放入可封装的容器内。 细胞培养样品的采集 器材与试剂：1.眼科剪，弯镊子、手术刀；2.装有无血清培养液或PBS（KCl,2.7mM;KH2PO4,1.5mM;NaCl 136.9mM;Na2HPO4, 8.1mM）的小瓶； 3.10ml、50ml小烧杯；4. 培养皿。 操作步骤： 采样时应严格无菌操作。采样时应用已灭菌的器械、无菌包装的器皿和经过滤灭菌的缓冲溶液和培养液。采样过程中尽量避免紫外线照射和接触对细胞有毒害作用的化学试剂。在有污染因素存在的区域采样时，应将样品在含有500-1000U/ml的青、链霉素的PBS中漂洗3次，每次1-2分钟。 在条件允许的情况下，宜采细胞易存活、增殖速度快的胚胎组织。 采样时应用锋利的器械切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 采样时应切除采样组织外的其它成份，如附着在采样组织上的血液、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织。修剪和切碎过程中，应将样品浸泡于少量培养液中，以避免组织干燥。 采取的样品应尽快培养。因故不能立即培养时，应将样品切成1cm3以下的小块，浸泡于培养液内，置于冰浴或4℃冰箱中。时间不能超过2小时。 采样的同时要留好组织学标本和电镜标本，以便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养后与原组织的差异性。对样品的来源、供体的一般情况（包括性别、年龄、健康状况等）要做详细的记录以备查询（见附表1）。 细胞的原代培养 器材与试剂：1.离心机，眼科剪，牙科探针;2.培养瓶（皿），吸管，小烧杯；3.PBS缓冲液，细胞培养液。 操作步骤： 对于样品量较少的组织，采用组织块培养法。 即将组织剪成小块后接种于培养瓶（皿）。具体操作规程如下： 将样品切成1mm3左右的小块。在剪切过程中，向样品滴加少量培养液，以保持样品湿润。 将剪切好的组织小块，用眼科镊子送入培养瓶（皿）内，用牙科探针或弯头镊子将组织块在瓶壁上均匀摆置，小块间距0.5cm左右。轻轻将培养瓶翻转，让放置样品的瓶壁朝上，向瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置入二氧化碳培养箱中。 放置3小时后，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，拧松瓶盖，静置培养。原代培养第4天时换液一次。 2 对大量样品的培养，宜采用组织分离的方法培养。 2.1组织的分离 2.1.2 培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，采用离心法分离。用小型台式离心机1000 rpm（约110-120G的离心力）离心5分钟（以下离心条件同），去除上清液。 2.1.3 对一些纤维成份很少的组织（如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织）进行分离处理时，在细胞培养液内用剪刀剪切后用吸管反复吹打分散细胞；或将样品挤压通过不锈钢网(孔径在80目以上)的方法进行分离。离心过滤液，收集细胞。去除上清液。 2.1.4 对于不适于上述两种方法分离的样品，采用消化分离方法，即将剪切成较小体积的组织块通过胰蛋白酶或胶原酶消化进行进一步的分散。对细胞间质较少的软组织，如胚胎、