猪用乙型脑炎减毒活疫苗的研制（王祥）..doc

猪用乙型脑炎减毒活疫苗的研制＊ 王 祥 陈焕春 何启盖 吴 斌 贾杏林 （华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室，武汉 430070） 摘要 选用原代金黄地鼠肾细胞作为基质，乙型脑炎病毒株SA14-14-2为生产毒株， 研制出了乙型脑炎减毒活疫苗，经小白鼠和本动物试验初步表明该苗具有良好的安 全性和免疫原性。 关键词 乙型脑炎减毒活疫苗；原代地鼠肾细胞；安全性；免疫性 猪乙型脑炎（猪乙脑）是养猪业的重大疫病之一，妊娠母猪通常表现为流产、死胎，公猪睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪脑炎[1,2]。此病造成的主要经济损失是怀孕母猪出现各种形式的繁殖障碍，直接影响猪群数量上的扩大，给养猪持续高产发展造成重大经济损失。此病分布范围广，在我国各地均有流行，尤其是海南、台湾、广东、福建等省常年有此病发生。近年来，从临床检测看猪乙脑有上升的趋势，江西省血清学调查表明猪群阳性率接近50%[ 3]，我室保存的送检血清阳性率也在40%以上。乙脑是由蚊虫传播引起的人畜共患传染病，我国是乙脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上，其病死率平均为20%，国外有的地方高达50%，约1/3的治愈者留有永久性神经精神后遗症，目前尚无有效药物治疗[ 4,5]。 人患乙脑，猪是主要的传染源，因此，预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。乙脑是自然疫源性疫病，在亚洲，特别是我国的广大农村，要消除蚊虫的滋生是不可能的，唯有大规模地接种高质量的乙脑疫苗才能最大限度地降低乙脑发病率。免疫接种是保护猪群的一项有效措施，我国目前猪用乙脑疫苗主要是鼠脑灭活苗，该苗含有较多的脑组织成份，接种者易发生严重的变态反应性脑脊髓炎，同时具有注射剂量大、需多次注射、效果不稳定及免疫力不持久等灭活苗所共有的缺点[ 6,7]。市面上有猪用传代细胞弱毒活疫苗，用传代的细胞制备活疫苗存在着致瘤的潜在危险性。针对我国目前尚无正式获批生产的兽用乙型脑炎减毒活疫苗，为满足防疫的需要，因此，我室选用原代地鼠肾（PHK）细胞作为基质进行了猪乙脑减毒活疫苗研制，并进行了疫苗的安全性试验和免疫原性试验，现将研究结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 疫苗毒株 选用乙脑病毒减毒株SA14-14-2作为生产用毒株。 1.2 原代地鼠肾（PHK）细胞制备及培养 选用12-14日龄健康金黄色地鼠致死，洗净，用0.1%新洁尔灭加适量甲醛浸洗2次后，浸泡30分钟，无菌操作从背部取出肾脏，收集于广口瓶中，剪碎至1-3 mm3大小，汉氏液洗涤组织块3次，加入0.1%胰酶，4℃过夜消化。取消化好的组织块、倾弃胰酶，用汉氏液洗3次，加少许生长液，用大口毛细管吹打数次，每次吹打5-20次，第一次吹打力量要轻，将每次吹打的细胞悬液集于大三角瓶中，然后用生长液稀释，每只地鼠消化约80-100mL细胞悬液，分装于104mL培养瓶中，37℃转瓶培养3-4天，细胞长成片后即可接毒。 1.3 接毒与收获 挑选无细菌和霉菌生长的成片细胞，倒去细胞生长液，用汉氏液洗2次，接103 TCID50的病毒量，接毒后35-36℃培养，观察病变，当细胞病变出现“+++”即收获放4℃待验。 1.4 疫苗原液效价测定 按常规方法将乙脑病毒悬液接种PHK或BHK21细胞，计算TCID50/1.0mL。 1.5 单瓶无菌试验 每瓶吸取样品分别接种于细菌培养基和霉菌培养基判定结果，单瓶无菌试验合格者，再经肉眼检查一次后用正压法将细胞病毒液混合，过滤即可制成湿苗，加入冻干保护剂冷冻干燥制成冻干苗。测定成品TCID50/1.0 mL 。 1.6 疫苗安全性试验 1.6.1 小白鼠脑内致病力试验 将疫苗原液脑内注射10-12g(3周龄)小白鼠10只，0.03mL/只，观察14天看有无死亡发生。 1.6.2 毒性试验 取12-15g小白鼠4只，腹腔注射疫苗原液，0.5mL/只，观察30分钟内有无异常情况，3天内有无死亡发生。 1.6.3 怀孕母猪安全试验 将疫苗原液静脉接种3头乙脑抗体阴性怀孕1周母猪，观察有无流产、死胎等异常情况。 1.7 疫苗免疫原性测定 1.7.1 小白鼠免疫原性测定 取7-9g小白鼠16只，分4组，皮下接种3批冻干苗，0.1mL/只，对照组注射无菌PBS。 1.7.1.1抗体水平测定 免后每间隔2周采血分离血清，用乳胶凝集试验（LAT）检测抗体水平。 1.7.1.2细胞免疫水平测定 取免疫鼠和对照鼠脾脏进行脾细胞增殖试验检测细胞免疫功能。 1.7.2 仔猪免疫原性测定 用冻干苗肌注6头乙脑抗体阴性40日龄仔猪，分1mL , 2mL, 3mL 3个剂量组，另设对照3头，按免疫后每周采血分离血清用血凝抑制试验（HI）和LAT检测抗体。 2 结果 2.1 疫苗效价 　 试验测得单瓶