(大三生物实验思考题.docVIP

1. 实验室常用的离心技术包括哪三种，各自分别有什么优点？ 差速离心:通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 优点：样品的处理量较大，可用于大量样品的初分离。 缺点：分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。产品的纯度和回收率都达不到理论值。 密度梯度离心:用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。包括等密度梯度离心和不连续密度梯度离心。 优点：：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。 等密度梯度离心:离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。优点：①分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 ②可以分离复合蛋白质，可以分离出处于不同结合状态的同一蛋白。 2. 一个典型的蛋白质或酶提取液包括有哪些组分，这些组分各起什么作用？在实验室里通常使用什么试剂？ 分为离子强度调节剂，pH缓冲剂，温度效应剂，蛋白酶抑制剂，抗氧化剂，重金属络合剂和增溶剂。 离子强度调节剂与pH缓冲剂：使蛋白质或酶尽可能处在体内环境的离子强度和pH值条件，使蛋白质或酶保持与体内相同的天然结构。实验室常用的试剂为含0.1-0.2M的Nacl或Kcl的PBS或TBS. 温度效应剂:防止过冷过热会引起蛋白质或酶分子变性失活。实验室常用试剂为甘油、二甲亚砜。 蛋白酶抑制剂：抑制细胞破碎释放出来的内源性蛋白酶，避免其将目的蛋白质或酶降解。实验室常用试剂为苯甲基磺酰氟（PMSF）. 抗氧化剂:防止细胞破碎后，目的蛋白质或酶被空气中的氧气所氧化，失去其天然结构。实验室常用试剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇。 重金属络合剂：避免金属离子引起的酶蛋白变性失活。实验室常用试剂为EDTA、EGTA(螯合钙离子)。 增溶剂：使膜蛋白溶解，细胞内容物释放。实验室常用试剂包括离子型去垢剂SDS、LDS、胆酸钠和脱氧胆酸钠；非离子型去垢剂Triton-100、吐温等。 3. 根据去垢剂的分子特点可以将其分为哪三种类型？它们各自的分子特点是什么？在蛋白质研究中有什么作用？ 去垢剂是能使蛋白质变性的一类化学物。 去垢剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，分为离子型去垢剂，非离子型去垢剂和两性去垢剂。 分子特点及作用： 离子型去垢剂含有带电荷的极性基团,又可以分为阳离子去垢剂和阴离子去垢剂 ,容易受到溶液离子成分的影响,可能会与离子交换柱相互作用,干扰蛋白质的纯化。所以利用离子交换柱纯化膜蛋白时,需要使用非离子型或者两性离子型的去垢剂。 非离子型去垢剂含有不带电荷的亲水极性基团,基本不受溶液中离子成分影响,能够破坏脂质分子间以及脂质分子与膜蛋白间的相互作用,但是不会破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用,因而常用于膜蛋白的活性分离和纯化。 两性离子型去垢剂同时具有离子型和非离子型去垢剂的一些特点:一方面,两性离子型去垢剂的极性基团不带电荷,不会同离子交换介质相互作用;另一方面,两性离子型去垢剂又能破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用。 4. SDS测定蛋白质亚基分子量的原理是什么？ ①在电泳前蛋白质会进行煮沸变性，使蛋白质的二三级结构破坏，使各亚基之间分离。 ②SDS胶是由丙烯酰胺单体聚合成聚合态，形成网状，起到分子筛的作用，③蛋白质会与SDS形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的