cell 工culture.doc

第六章 植物细胞培养与有用物质生产 第一节 细胞悬浮培养 一、细胞悬浮培养 指将植物体游离的细胞或小的细胞团，按照一定的密度，悬浮于液体培养基上，在摇床或转床上进行培养，在培养的过程中始终保持良好的分散性。 特点:P81 良好细胞悬浮系的特点 （1）分散性好，细胞团小或成单个游离细胞 （2）细胞比较均一，细胞大小、形状大致相同 （3）生长迅速，生长速度比愈伤组织快 良好细胞系的建立: ?诱导疏松易碎的愈伤组织容易建立良好的细胞悬浮系 ?悬浮细胞培养培养基组成一般与愈伤组织培养基相似(条件培养基使用,新:旧=3:1) 二、细胞悬浮培养的一般程序 ?单细胞的游离 ?悬浮细胞的初代培养 ?高产细胞株的筛选 ?继代培养 ?同步化处理 细胞悬浮培养的一般程序（图） 1单细胞的游离 （1）由培养愈伤组织中游离单细胞 愈伤组织的振荡培养法游离单细胞的程序（图） （2）由完整植物器官中游离单细胞 机械研磨法、果胶酶分离法 2悬浮细胞的初代培养 （1）培养基的选择 碳源 N源 磷酸盐 PH缓冲液（MES） 条件培养基 （2）细胞的起始密度与细胞计数 ?细胞密度：指单位体积内细胞的数目，常以每ml培养液中含多少细胞表示。 ?细胞的起始密度：又称最低有效密度，指开始培养时，单位体积内的细胞数目。即悬浮细胞培养中，能使细胞分裂、增殖的最低接种量。（104-105个/ml） ?细胞计数 （3）细胞活力测定 ?FDA染色法：FDA荧光素双醋酸酯，本身无荧光，无色素，但FDA能穿过完整的原生质体膜进入细胞内部，并受到细胞内酯酶的分解，产生有极性、有荧光的物质-荧光素，在荧光显微镜下，有荧光的细胞，具有活力的细胞。 ?酚番红染色： 3.高产细胞株的筛选 细胞株是指起源于单个细胞的细胞团或细胞系。 采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株进行培养，是取得成功的关键。 ▲细胞生长的计算 a细胞鲜重的增加；细胞干重的增加； b细胞密实体积的改变（PCV）： 取10mL细胞悬浮液，放入15mL刻度离心管中，在2000rpm下离心5min，在离心管底可得到细胞沉淀体积，即细胞密实体积，以每毫升细胞悬浮液中细胞沉淀体积的毫升数表示。 4 细胞悬浮(扩大)培养的方法 （1）分批培养 ?特点：是指把植物细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，在培养的过程中 除了气体和挥发性代谢物质可以同外界进行交换外，一切都是密闭的，当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长停止。 ?注意：培养基的使用（旧：新=1：4） ?特点：不断加入新鲜培养基，排出用过的培养基。 （2）连续培养 ?开放式连续培养 ?封闭式连续培养（细胞数量逐渐增加） 5 悬浮细胞的同步化 （1）同步化：指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 （2）同步化方法 离心 过滤 低温 第二节、单细胞培养 一、单细胞培养的方法 1平板培养（platinｇ） 指将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在１ｍｍ厚的薄层固体培养基上进行培养，称为“平板培养”。 ?特点 ?植板率 2看护培养 有些植物细胞，一旦分离出来，不仅不能分裂、增殖，还可能死亡，如果用一块愈伤组织来哺育细胞，从而使其正常分裂、增殖的方法，称“看护培养”。（植物杂种胚的胚乳看护法动画） 特点：方便、简单，但不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成。 3微室培养： 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称“微室培养”，也称“双层盖玻片法”。 特点：能在显微镜下追踪观察单细胞分裂和增殖形成细胞团的过程。 二、植物单细胞培养的程序 ?建立细胞株 ?高产细胞株的筛选 ?分化培养或扩大培养 ?鉴定提取 第三节 固定化培养 一、细胞的固定化概念 即把细胞固定在一种惰性基质中，细胞不能移动，而营养液可以在细胞间流动，供细胞生长所需的营养，这种培养方式称为细胞的固定化培养。 二、.固定化特点 （１）使细胞处于类似植物的整体环境中。 （２）细胞生长速率慢。 三、固定化细胞反应器 （１）平床式反应器 （２）柱式反应器 （３）膜式反应器 第四节 植物细胞培养的应用 １用于制造人工种子。 ２可得到原生质体（融合、遗传转化受体）。 ３进行植物细胞的生产。 ４进行突变体筛选。 ５初生代谢产物和次生代谢产物的生产。 ▲初生代谢产物（Primary metabolism) 指维持细胞生命活动所必需的物质，如蛋白质，核酸，糖类，脂类。 ▲次生代谢产物（Secondary metabolism) 指由植物细胞产生的，对植物生长、发育并非必需的一类小分子有机化合物，往往具有特定的功能。其产生和分布通常具有种属、器官、组织和发育时期的特异性。光、激素、温度、氧气以及外界的pH都