第七讲噬菌体载体与柯斯载体..docVIP

第七讲 噬菌体载体与柯斯载体 吴 乃 虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2005年8月  目 录 一、噬菌体的一般问题 1．何谓噬菌体 2．噬菌体效价测定与双层平板法 3．噬菌体的生命周期 4．噬菌体的溶源生命周期 5．超感染免疫 6．溶源性的诱发 7．Campbell模型 二、?噬菌体载体 1．?噬菌体的生物学概述 2．?噬菌体载体的构建 ?噬菌体载体构建的基本原理 插入型载体 替换型载体 3．?噬菌体载体的改良 Spi-正选择的?噬菌体载体 具有内删除特性的?噬菌体载体 4．?重组体DNA分子的体外包装 ?重组体DNA的转染作用 ?噬菌体的体外包装 5．?噬菌体DNA的包装限制问题 包装限制的概念 包装限制与?噬菌体的克隆能力 包装限制的生物学意义 6．?重组体分子的选择方法 cI基因功能选择法 lacZ基因功能选择法 Spi-选择法 三、柯斯质粒载体 1．柯斯质粒的定义及其构建 ?噬菌体的克隆能力 柯斯质粒载体定义 柯斯质粒pHC79的构建 柯斯质粒克隆能力及其组成 2．柯斯质粒载体的特点 3．柯斯质粒载体的改良 4．柯斯克隆 定义 理论依据 柯斯质粒包装条件 柯斯克隆程序 柯斯克隆的优点 5．柯斯克隆的改良 柯斯克隆的局限性及其克服办法 Ish-Horowicz-Burke克隆方案 Bates-Swift克隆方案  噬菌体载体与柯斯质粒载体 一、噬菌体的一般问题 1．何谓噬菌体？ (1)定义 噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称 需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。 “phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。例如：试管中含有T4和T7等多种phages。 (2)噬菌体的核酸类型及结构 *1.与质粒相比，噬菌体的结构显然要复杂得多，但与细菌或真核细胞相比，则显得十分简单。它的DNA分子中除了复制起点之外，还编码着外壳蛋白质的基因。 噬菌体的核酸最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA及单链RNA等多种形式。 *2.不同的噬菌体颗粒结构相差甚大，可归结为如下三种基本类型： 无尾部结构的二十面体型； 具尾部结构的二十面体型； 线状体型。 图7-1 T2噬菌体颗粒的结构示意图 迄今已知的大多数噬菌体都是属于第二种结构类型(图7-1)，在其二十面体型的头部下端，连接着一条尾部结构，恰似一种小型的皮下注射器。 2．噬菌体效价测定与双层平板法 (1)效价定义 效价(titer)又叫滴度，系指单位体积的噬菌体制剂中所含有的具感染能力的噬菌体颗粒的数目。它以每毫升噬菌体制剂中的噬菌斑形成单位pfu/ml表示。 (2)效介的测定(titering) 10倍稀释法与双层平板法 (3)噬菌斑形态 混浊型与清晰型 3．噬菌体的生命周期 (1)噬菌体的生命周期包括 *1.溶菌生命周期——产生子代噬菌体 *2.溶源生命周期——不产生子代噬菌体 (2)烈性噬菌体和温和噬菌体： *1.烈性噬菌体——只具有溶菌周期的噬菌体(phage) *2.温和噬菌体——具有溶源周期的噬菌体 (3)烈性噬菌 溶菌生长周期： 吸附—注入—转变—合成—组装—释放 4．噬菌体的溶源生命周期 (1)若干基本概念 *1.温和噬菌体(temperate phage) 既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。 *2.溶源性细菌(lysogen) 在染色体基因组上具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 如果某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能够完成其溶菌周期，故含有这样噬菌体的细菌，叫做缺陷性的溶源性细菌。 *3.溶源化(lysogenization) 用温和的噬菌体感染细菌培养物，使寄主细菌转变为溶源性细菌的过程，叫做溶源化。 溶源化的分子本质是噬菌体的DNA整合到寄主细菌染色体基因组DNA之中，成为它的组成部分。 *4.整合(integration) 噬菌体DNA组入寄主细胞染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入(insertion)。整合的准确定义是：小分子量的DNA分子插入到大分子量的DNA分子中的重组过程。 参入(incorporation ) *5.原噬菌体(prophage) 在溶源性细菌中存在的处于抑制状态的整合的或非整合的噬菌体DNA叫做原噬菌体 5．超感染免疫(再感染免疫) (1)超感染免疫定义 溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌