【2017年整理】mRNA差别显示技术.docxVIP

mRNA差别显示技术 mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装 。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。（见示意图） 实验流程：Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装 对照组的总RNA提取 mRNA完整性鉴定 实验组的总RNA提取 mRNA完整性鉴定 ↓ ↓ 锚定引物逆转录成cDNA 锚定引物逆转录成cDNA ↓ ↓ 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 ↓ ↓ 扩增产物进行凝胶电泳分析 ? 差异性条带的回收与第二次扩增 ? Northern杂交，Southern杂交再次确定差异性条带的真实性 ? 差异性条带的克隆、测序、分析，DNA及氨基酸序列联机检索 ? 以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因 序列及cDNA文库中的全长cDNA序列 ? 基因功能的鉴定： ①knock out ②dominant negative mutation ③原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制 备，细胞内的定位，抗体抑活等等。 ④one hybrid判断出该基因的“启动”基因。 ⑤two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。 这里以CLONTECH生产的DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。 操作步骤 1．总RNA的提取（见Northern 杂交） 2．第一链合成： (1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。 (2)混匀后稍离心。 (3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。 (4）准备dNTP mix (以5管为例 ) 每管 5管 5×第一链缓冲液 2μl 10μl dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl MMLV逆转录酶（200u/μl） 1μl 5μl 总体积 5μl 25μl (5）每管加