第五章基因工的重组2007.pptVIP

用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 该法是197年Mande和lHiga发现的，并且1972 Cohen 做实验进一步验证。 其转化效率为每微克质粒DNA可以获得5×106---2×107的转化菌落。 转化的可能原因为：在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基——磷酸钙复合物，并粘附在细胞膜的外表面上，当42 ℃热击短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获裸露的噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 DNA分子转化受体菌获得转化子的效率 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培养液 37°C中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等成功的用于大肠杆菌的转化。 其原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促使外源DNA的有效吸收。 电穿孔转化的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA的浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到109~1010转化子。 电压增大或脉冲时间延长均将提高转化效率，但受体细胞的存活率降低。 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。 第三节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 1. 菌株选择 如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his3?1 * * 怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去? 在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子? 答: 这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。 化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 第五章 基因的重组与转移 载体去磷防止连接反应中的载体自连 P