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动物细胞融合 （电刺激法） 实验大纲： 细胞融合概念 融合方法以及之间的优缺点比较 实验原理 实验用品 实验步骤 实验仪器试剂表 注意事项 预期结果 发展趋势 一、细胞融合概念 细胞融合概念：指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的过程。它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为有效的手段。 二、融合方法： 1.病毒促进细胞融合 融合过程图： 四、电刺激法的优点： 与化学方法（PEG融合）比较： 1、不存在对细胞的毒害； 2、融合效率高； 3、融合技术操作简便。 与生物方法（病毒诱导）比较： 电击法无毒性，增加了实验的安全可靠性。 自身优点： 再加上本身具有以下这些优点： 融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 具有的可重复性 所以本组采用了电刺激法诱 导动物细胞融合。 电刺激法的仪器 电融合仪器技术的原理：（可选讲） 电融合技术的原理是：在短时间强电场(高 压脉冲电场，场强为kV／cm量级，脉冲宽度为卜q量级)的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿， 瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分 钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细 胞的接轴区时，即可诱导它们的膜相互融合，导 致细胞融合。该方法具有直观、定向、高效的优点。 五、实验步骤 XY 4、用移液枪将细胞悬液吸入电融合室中，置于显微镜下接上电极，待观察。 5、给细胞悬液施加正弦交变电场，由低到高分别调节交变电场频率和电压， 直流脉冲可调节参数为电压、脉冲宽度、间隙时间、脉冲个数等，在原生质体相互成串后，发生有效接触后，立即由低到高施以电脉冲。显微镜下观察，可见原生质体迅速排列成串。 XY 6、静止片刻在显微镜下观察细胞在被施加电脉冲前后的变化及融合的情况选择确定。 （以下部分选讲） 7、用移液器向电融合室中吸出原生质体悬液滴片，马上进行台盼蓝染色，观察并计算细胞的融和率和成活率，计三个视野，取其平均数。 六、实验仪器、设备、器具表 实验试剂表 七、注意事项 八、预期结果 显微镜下可观察到细胞融合的全过程，并且可见一些已经完全融合的动物细胞。 九、体细胞杂交研究的发展趋势： * LOGO 大部分同学都是用的PEG法，所以这里我就不再介绍了。 第一种： 自发融合：受精过程，成肌细胞融合，巨噬细胞融合，体外培养系统中的细胞融合。 第二种： 化学法： PEG法-融合 生物法： 病毒诱导法 物理法： 电刺激法 诱导融合 病毒类融合剂是研究的最早的促融剂，一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但由于毒性大，应用上收到很大限制。 仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。 三、电刺激法原理： Sub Title Sub Title 融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 1、将制备细胞悬液以1000r／min离心5min ，用超纯水配制的0.7mol／L甘露醇清洗，重复两次。 2、吸去上清夜，再用0.7mol／L甘露醇将细胞密度调整成5×104个／ml混匀。 3、开启电融合