发明专利撰工写模板 生物类 龙图腾网提供一个能用于构建cDNA文库和功能筛选的载体构建的方法.docVIP

说 明 书 本发明涉及μ ori, LEU2, GAL4AD, PADH1, TADH1, SV40 NLS, HA Tag等。 有益效果： 本发明获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。 附图说明： 图1 pGADT7多克隆位点； 图2 pDNR-LIB多克隆位点； 图3 pGADT7M多克隆位点； 图 4 部分重组子的菌落PCR结果图。 具体实施方式实施例 1 总RNA的提取50-100 mg组织样品，用0.75m TRIZOL? LS试剂匀浆，1530℃静置5 min。加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15后，1530℃静置215 min。4℃、12,000离心min，上l异丙醇，15-30℃静置min后，4℃、12,000离心min，1 ml 75%乙醇漂洗沉淀，5,000 g离心5 min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1 (l进行1%甲醛变性胶电泳，1 (l用紫外分光光度计分别测定样品在260 nm、280 nm波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，-0℃保存备用。μl. (2) 65oC加热10 min。 (3) 加入3 μl生物素标记的Oligo(dT)和13 μl 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷却至室温，一般需10 min左右。 (4) 同时配0.5×SSC 1.2 ml和0.1×SSC 1.4 ml. (5) 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3 ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。 (6) 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1 ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30 min内使用。 (7) 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 min。 (8) 用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。用0.1×SSC,每次0.3 ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不搅动SA-PMPs. 将SA-PMPs重新悬浮在0.1 ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。 (9) 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。 (10) 将SA-PMPs再悬浮于0.15 ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。 (11) 将得到的mRNA溶液取几微升进行凝胶电泳分析，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。 (12) 加0.1体积的3 M NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20oC沉淀过夜。 (13) 4oC，13,000 g离心60 min。去上清，加入500 μl 70%乙醇混匀。 (14) 4oC，7,500g离心10 min。 (15) 去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。 (16) 重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。 注意事项：所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行；如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。 3 cDNA的合成 按CLONTECH公司SMARTTM cDNA Library Construction Kit说明书操作。其原理是利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G（m7G）且5’三磷酸键连接的特殊的帽子结构和3’端的PolyA尾的特点设计锚定引物, 分别进行第一链合成，引物延伸合成第二链，酶切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA的目的。 1） cDNA 第一链的合成 在5 μl 反应体系中加入下列组分（于冰上操作）：1 μgRNA， SMART I olignucleotide和CDS III∕3’PCR 引物1 μl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃温育2 min，冰浴2 min，短暂离心，使混合物集于管底。依次加入2 μl 5×First Strand Buffer 、 1 μl 20mmol/L 的DTT、1 μl 10mmol/L 的dNTP Mix 和1 μl PowerScript RT（CLONTECH）后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1 hr 逆转录合成第一