基因表达干工扰技术Microsoft PowerPoint 演示文稿.pptVIP

基因表达干扰技术 基因表达干扰技术 一、反义核酸技术 概念: 反义核酸:是根据碱基互补原理设计的,针对 特定靶序列互补的DNA或RNA片段，通过与特定靶序列结合，从而抑制特定基因的表达。 反义核酸技术:是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体内合成的特定互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术 种类：反义DNA 反义RNA 来源：人工合成 生物合成 （一）反义寡核苷酸(反义DNA)（ASON）技术 反义DNA:是人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。 1.反义寡核苷酸的作用机制 (1) 抑制mRNA的翻译 (2) 抑制复制或转录 (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达 降解 反义核酸 靶核酸 二聚体 空间阻碍 2.反义寡核苷酸的给药途径 （1）直接作用于培养细胞 （直接进入细胞） （2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （通过载体进入细胞） （3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、 肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径 （二）反义RNA技术 1.反义RNA的作用机制 (1) 抑制DNA复制：与引物RNA结合，抑制复制 (2) 阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运 与mRNA互补结合影响加帽、剪接和加尾 (3) 抑制mRNA翻译 与5′端SD序列、起始密码AUG结合，影响翻译 (4) 使mRNA更易被核酸酶识别而降解 2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单 PCR→反义基因+载体→重组反义基因→细胞→反义RNA （三）反义核酸技术的应用 1.基因分析 2.可作为探针进行原位杂交，分析基因表达 3.用于病毒病、肿瘤及遗传性疾病的治疗 二、核酶与脱氧核酶 （一）核酶 核酶是一类具有催化作用的RNA分子， 能够特异性地剪切底物RNA或突变的RNA。 1.核酶的分类 （1）大分子核酶： （2）小分子核酶 ： 2.核酶的结构 （1）锤头状核酶： 二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心 （2）发夹形核酶： 每个结构域由 螺旋-环-螺旋组成 3.核酶的设计与修饰 设计：核酶核心与结合臂的设计 在底物RNA中选择最佳的剪切位点 修饰：防止被核酸酶降解 4.核酶转移方法 核酶需转入细胞内才能发挥功能 方法：外源性转移 内源性转移 5.核酶的应用 病毒性疾病的治疗 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 艾滋病毒 肿瘤的治疗 （二）脱氧核酶 具有催化作用的DNA（人工合成） 1.脱氧核酶的结构种类及特征 （1）10-23型脱氧核酶： （2）8-17型脱氧核酶： 2.脱氧核酶的催化特性 （1）RNA切割活性 （2）DNA连接酶活性 （3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性 （4）DNA切割活性 （5）N-糖基化酶活性 （6）DNA激酶活性 （7）DNA戴帽活性 三、小干扰RNA RNA干扰（RNAi）：利用特定的小分子单链 RNA与一条mRNA的互补区发生碱基 配对，从而阻遏这条mRNA的表达。 把这条小分子的RNA称为小干扰RNA（siRNA）  （一）一般研究路线 （二）RNAi的作用机制 1.起始阶段 2.效应阶段 3.倍增阶段 （三）siRNA的导入 1.脂质体或电穿孔 2.病毒携带 3.细胞穿透肽 （四）RNAi沉默效果的检测