细胞生物学_ 第三章.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法 一、细胞形态结构观察 〈一〉光学显微镜 ⒈普通光镜的性能指标：放大率（放大倍数），分辨力，清晰度、焦点深度，镜象亮度 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力，通常是以分辨距离来表示的，即分辨距离越小，则分辨力越高。 人肉眼分辨力测试，是规定在明视距离为25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的极限值是0.1 mm毫米。显微镜的分辨力可按下列公式来计算 : R=0.61 λ / N·A （R是分辨距离，0.61是常数，λ是照明光波波长，N·A是显微镜物镜的镜口率—光学性能指标，每个物镜的外壳上都标有其镜口率的数值）。 ∵分辨距离R与镜口率N·A成反比关系 ∴若把最大镜口率1.25（ 即油镜镜口率）代入公式，可见， 最小分辨距离 ≈λ∕２ 。 由于可见光中最短波长（紫光）0.4μm（即400nm）， ∴普通光镜最大分辨力的理论极限应为0.2μm。 请记 住 0.2μ !!! 这个数值就是显微 水平与亚（超）微水平的分界线。 ∵显微镜的分辨力有一定的极限， ∴其放大率受分辨力制约而不可能无限提高。 普通光镜放大率的经验界值：有效放大倍数极限 ═ 物镜最大镜口率×1000 例： 普通显微镜的油镜镜口率为1.25，故此台显微镜的最大有效放大倍数为1250倍。 高级研究显微镜的油镜镜口率为1.4，则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。 如果放大倍数超过限度， 则视野中物象会变模糊 ，细微结构反倒分辨不清 ，成为了 无效放大。 由于物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制， 不可能再更进一步提高了。 所以科学家们从另外两个途径来改进显微镜： i.换用短波长的“照明光源”，来提高分辨力。如： 紫外光显微镜、电子显微镜 ii.应用特殊光学效应， 增强反差， 来提高分辨能力。 如：相差显微镜、微分干涉显微镜 ⒉相差显微镜 phase contrast microscope 原理：光波的三个光学特性：（1）光波有波长。 对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化;（2）光波有振幅。 对于光波振幅变化（即振幅差），肉眼觉察为明暗变化； （3）光波有相位（ 相位是指某一时刻， 光在其前进路线上的位置）。对于光相位的变化（即相位差），肉眼是不能觉察的。 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（如活细胞），其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现了一定程度的变化，此时观察会感觉反差较小，对物体内部的结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因。 相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地促使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而造成反差增强，便能够清晰看到被检物体及其内部细微结构了。所以，相差显微镜下的样品标本不需染色，即可以十分清晰地观察活细胞及其内部结构的变化。 特点： 相差显微镜的观察效果是被检物体比其周围背景略暗，而物体外围显现有一圈明亮的光环。 倒置显微镜则是将相差显微镜的构件颠倒装配，本末倒置而成的，并装有恒温设备、闭路电视和缩时摄象机，是能够完善适用于细胞培养的观察监视系统。 微分干涉显微镜却是另一种不需染色而可以直接观察活细胞精细结构及动态变化的技术设备，其分辨率比普通光镜要提高一个数量级。 3.荧光显微镜 fluorescence microscope 原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析。荧光现象有两种：1.自发荧光—细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所 激 发 的 荧光， 例，叶绿素—血红色自发荧光；2.诱发荧光—在细胞中加入某种不会使细胞化学组分变性的荧光染料（ 荧光素 ）， 与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。 结构特点：1 采用紫外光发生装置： 高压汞灯 + 激发装置 + 滤光装置 2 透镜由石英玻璃制成，以便减少光通路上的紫外光损耗 3 目镜中要装压紫滤片 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定位分析或对某些特定蛋白质进行定性定位检