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第三章 酶蛋白的结构 蛋白质的一级结构（primary structure） 蛋白质的二级结构（secondary structure） 蛋白质的三级结构（tertiary structure） 蛋白质的四级结构（quaternary structure） 蛋白质结构和功能的关系 举例：镰刀状细胞贫血病 镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。 镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体蛋白质，由两个α亚基和两个β亚基组成（α2β2），其中α亚基包含141个氨基酸残基，β亚基包含146个氨基酸残基。镰刀状细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的β亚基N-末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度极性的Glu变成了非极性的Val 这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个β亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。 牛胰核糖核酸酶复性实验 8个Cys－SH形成4个二硫键的组合方式有7×5×3=105种，因而重新形成正确配对的概率仅1/105， 第一节 蛋白质一级结构研究方法 1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 6.多肽链的局部断裂和肽段的分离 7. 测定各个肽段的氨基酸顺序 8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 9. 多肽链中二硫键位置的确定 1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 电泳单一带 SDS测分子量（质谱法） 2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 末端分析法 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 氧化法 氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，不会重新形成连接，但在氧化过程中伴随着一些副反应，Met侧链被氧化生成亚砜，Trp侧链被破坏。 还原法 为了防止游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化 4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸 1）酸水解： 作水解程度时间图确定最佳时间 1-10mg蛋白样品 → 加HCl → 抽真空 → 封闭 → 烘箱 特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质 b）? Ser、Thr、Tyr部分破坏，Ser破坏10-15%，Thr、Tyr破坏5-10%，应予以校正 c）? Asn → Asp Glu → Gln d）? 胱氨酸→半胱氨酸 e）? 大部分氨基酸不破坏 2）碱水解： 特点：a)Trp不破坏 b）大部分氨基酸破坏 分离检测：1）纸层；2）薄层；3）离交；4）氨基酸自动分析仪 5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 目的：有几条肽链；N、C末端是何氨基酸 测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被保护试剂保护；末端是Pro 5-1 N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点） 1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法） a）原理： b) 分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶 标准Aa + DNP——反应——纸层——喷茚三酮 未知DNP-Aa-——纸层——喷茚三酮 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优点：反应条件温和，末端产物易分离 缺点：N端是Pro测不出；不能进行N端测序 Lys的另一氨基生成e-DNP-Lys，由于它不溶于乙醚故不影响测定结果 2) 丹磺酰氯法（DNS法） a) 原理： b）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶 标准Aa + DNS——反应——纸层——荧光显色 未知DNS-Aa-——纸层——荧光显色 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，样品量为0.1-2ng 缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、Try测不出；不能进行N端测序 3) Edman降解法[苯异硫氰酸酯法（PITC法)] a) 原理： a）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶 c）优点：N端是Pro可测；能进行N端测序 缺点：灵敏度稍差 4）DansyCl-Edma