【2017年整理】生化检测技术(10-12.docxVIP

2014-02-10—2014-02-12学习总结： 一、常用的生化检测方法 终点法 通过检测终点吸光度变化的大小来求出被测物的含量。 选择终点法的重要因素，终点时间的确定 根据时间—吸光度曲线来确定：选取吸光度趋于稳定后的时间 根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定 如:溴甲酚绿法测血清白蛋白 溴甲酚绿（BCG）是一种pH指示剂，变色域3.8（黄色）-5.4（蓝绿色） 溴甲酚绿不但与清蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以a1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较清蛋白稍慢。由于在30s内呈色对清蛋白特异，所以溴甲酚绿与血清混合后，在30s内读数可明显减少非特异性呈色反应。 一点终点法 反应达到终点，即在时间—吸光度曲线上，当吸光度不再改变时，选择一个终点吸光度值。待测物浓度=（待测吸光度AU-空白AB）*K(校准系数) 两点终点法 在被测物反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应达到终点或平衡时，选择第二个吸光度，用两次吸光度之差计算结果。 优点：有效地消除溶血、黄疸和脂浊本身光吸收造成的干扰，适应于反应初期吸光度无明显变化的被测物。 固定时间法 在时间—吸光度曲线上选择两个测光点，既非反应物初始也非终点，差值用于计算结果 例：苦味酸法测定肌酐，反应初30s,血清中快反应干扰物（微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）与碱性苦味酸反应；第二个30s主要与肌酐反应，并且吸光度线性良好；80-120s之后，苦味酸可以与蛋白质以及其他慢反应干扰物反应。所以用第二个30s为测定时间，有利于提高试验特异性和准确性。 连续监测法 也称速率法，测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选择时间—吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值 △A/min计算结果 二、了解免疫学检验常用的技术 免疫比浊技术 原理：免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。 透射 散射 粒子强化免疫浊度测定法 备注 测定原理 测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减，读数以吸收光单位（A）或OD表示 根据雷利公式，当复合物较小时，呈全透射，透射与散射相当。当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，散射的量代表复合物的量。 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则大声聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。 优点 简单实用 检测快速，精密度高，灵敏度高 缺点 准确性低，周期长 需要特定仪器 影响因素 抗原抗体组分：透射比浊法保证抗体组分在3%一下，散射比浊0.5%以下 抗体纯度和效价 增聚剂（聚乙二醇，一般3%—4%） 生物素与链霉亲和素的应用技术 金标记免疫技术 免疫胶体金技术是指以胶体金为标记物，应用于免疫组织化学及免疫分析中，对细胞或某些标本中的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位及定性检测的一种免疫学技术。用于疾病检测和诊断的的快速检测试剂主要分两大类，一类是渗滤法或称为滴金免疫渗滤实验，它可以理解为一种以免疫胶体金代替酶标抗体的斑点ELISA。另一类是免疫层析法，是一种侧向横流形式的免疫实验。这两类所涉及的原理基本是相同的，但前者操作稍为复杂，目前在研究、开发、生产及使用领域占主导地位的，主要是层析法检测试剂。 免疫胶体金的制备原理????? 胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，金离子还原后聚合成的一定大小的金颗粒，它由一个基础的晶核（11个金原子形成的二十面体）和包围在外的双离子层构成（内层为负离子层AuCl2－，外层是带正电荷的H＋）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。除了与蛋白质结合以外，它还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。????? 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。用于胶体金标记的蛋白必须要经过前处理，其目的在于 （1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。 （2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋