第二章、第三章_外植体的选择和消毒解决方案.pptVIP

第一节 培养基的成分 第二节 培养基的配制 第三节 常用培养基的配方 第一节 培养基的成分 第二节 培养基的配制 一、准备工作 二、母液的配制与保存 三、培养基的制备 四、培养基的灭菌 第二节 培养基的配制 准备工作 母液的配制与保存 培养基的制备 培养基的灭菌 一、准备工作 器具：不同型号的烧杯、容量瓶、移液管、滴管、玻棒、三角烧瓶及培养基分装器等; 水：一般用蒸馏水或无离子水，精细的实验须用重蒸馏水; 药品：化学纯CP(三级)和分析纯AR(二级)，以免杂质对培养物造成不利的影响。药品定容要准确，不同化学药品的称量需使用不同的药匙，避免药品的交叉污染与混杂。 二、母液的配制与保存 1.母液的配制方法 单配法：用a:b表示 混配法：用amg/L表示 2.母液的配制过程（MS） 4）铁盐母液 生长素类： 一般，先用少量95%酒精助溶； 2，4—D，O.1mol/L的NaOH或KOH助溶; 单位：0.1-5mg/ml 细胞分裂素类: 一般,先用少量1N盐配溶解,再加温水冷却后定容 附：母液的配制及保存的注意事项 药品称量应准确，尤其微量元素化合物应精确到0.0001克，大量元素可精确到0.01克。 配制母液的浓度适当：一是长时间保存后易沉淀，二是浓度大，用量少，在配制培养基时易影响精确度。 母液贮藏不宜过长，一般几个月左右，要定期检查，如出现浑浊、沉淀及霉菌等现象，就不能使用。 母液应放在2－4℃的冰箱中保存。 三、培养基的制备 1、称量琼脂和蔗糖并溶解（固体培养基）： 蔗糖3%，琼脂0.6-0.8%，加水为最终培养基的1/2 到2/3 2、加母液 3、定容 4、调pH 5、分装 6、包扎瓶口 7、灭菌 8、保存 附：计算：制做3L MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l +蔗糖3%+琼脂0.6% 需要母液各多少？ 大量元素母液（10倍） ——ml ？ 微量元素母液（100倍） ——ml ？ 铁盐母液 （100倍） ——ml ？ 有机物质母液（100倍） ——ml ？ 6-BA母液 (0.1mg/ml) ——ml ？ NAA母液 ( 0.1mg/ml) ——ml ？ 蔗糖 ——g ？ 琼脂 ——g ？ 参考公式： 四、培养基的灭菌 1、湿热灭菌： 锅内保持1.1Kg/cm2的压力,温度121℃左右，大约15－30分钟即可。 2、过滤灭菌： 原理： 注意事项：完全排除锅内空气 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa，20min。 步骤： ⑴ 放水至平把架； ⑵ 把包扎好的培养基装入高压锅； ⑶ 盖上内锅盖,上紧螺帽，关上气阀和安全阀； ⑷ 然后接通电源、设置温度和时间； ⑸ 排冷空气（自动）； ⑹ 记时（自动） ⑺ 到时，关电源，降压至0，打开放气阀； ⑻ 开盖拿培养基 注意：经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。 第三节 常用培养基的配方及特点 二、培养基的种类及其特点 1）MS 培养基 产生：1962年，Murashige和Skoog； 特点：无机盐的浓度高，是稳定的平衡溶液； 2）White培养基 产生：1943年，White，1963年改良； 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养； 3）N6培养基 特点：KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼，适于禾谷类植物花药和花粉培养； 4)B5培养基 特点：铵盐含量低，硝酸盐含量高，适合于双子叶植物特别是木本植物的生长； 5)KM-8P培养基 1974年,原生质体培养而设计的。 特点:有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，适合原生质融合的培养。 一、植物基因型 二、外植体部位 三、取材季节 四、外植体的生理状态和发育年龄 五、外植体大小 草本植株木本植物； 双子叶植物单子叶植物； 木本植物中，猕猴桃较易再生植株；而干果 类、松树、柏树等就比较困难； 植物基因型不同，组培再生途径也不同 生长健壮无病虫害的植株； 同一植物不同部位之间的再生能力差别较大； 茎尖； 茎段、叶片及其它 植物生长的最适时期：生长开始的季节 如苹果芽、百合鳞片 越嫩，年限越短的组织具有越高的形态发 生能力，如生菜的心叶。 胚胎培养或脱毒，外植体宜小 快速繁殖，外植体宜大 一般外植