重要疾病相关膜蛋白的结构和功能..docVIP

项目名称： 与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能 施一公 清华大学 2009.1至2013.8 教育部  二、预期目标 总体目标： 膜蛋白结构生物学是当今结构生物学研究的最前沿、最重要的领域之一，已知的膜蛋白结构只有350个，其中还包含了大量外膜蛋白、同类膜蛋白的同源物、突变体等等，因此新颖膜蛋白的结构信息极其贫乏。我们的总体目标是解析有重要科学价值并与重大疾病相关的新型膜蛋白的高分辨率结构，探索真核膜蛋白表达结晶的普适方法，培养一批膜蛋白结构生物学人才，促进中国结构生物学在膜蛋白结构与功能领域进入世界领先水平。 五年目标： 摸索超量表达重组真核生物膜蛋白的体系，包括CHO细胞表达体系、昆虫细胞表达体系、酵母表达体系、细菌表达体系、体外翻译体系、植物表达体系等等，力求摸索出可以稳定大量表达各类真核生物膜蛋白并且完全保留生物活性的性价比最高的生物表达系统； 探索膜蛋白结晶条件的规律以及更适合膜蛋白结晶的沉淀剂、添加物； 解析γ-Secretase及类似膜蛋白酶的原子分辨率的结构，阐述其工作机理； 解析胆固醇代谢通路上重要的膜蛋白及其复合物的结构2-4个，揭示胆固醇代谢通路调控机理； 探索盒式突变技术和融合蛋白技术在GPCR结构生物学研究中的可行性，解析出1-2个多巴胺受体或其它膜蛋白的晶体结构。 解析肺炎链球菌具有免疫原性的膜表面蛋白及其与宿主受体蛋白的复合物的精细三维结构，并表达、纯化、结晶和结构解析重要的跨膜转运蛋白。 发表国际一流杂志论文（影响因子10以上）20篇以上，其中Cell、Nature、 Science论文5篇以上；培养一批膜蛋白结构生物学人才；使中国的膜蛋白结构生物学研究居于世界领先水平。 在结构生物学领域造就一支高水平的科研队伍，培养一批杰出的博士研究生（40－60名）、硕士研究生（10名左右）和博士后研究人员（10-20名）。 三、研究方案 1．学术思路 本项目的中心学术思想是发挥我国的人才资源优势，结合强有力的财政支持，集中力量攻克有重大科学意义、备受关注的膜蛋白γ-Secretase，与心血管疾病相关的胆固醇代谢通路上的一系列起调控作用的重要膜蛋白，几个GPCR蛋白的结构，以及致病微生物表面膜蛋白的结构。本项目所有4个课题的核心都是膜蛋白结构与功能的研究，彼此研究方向及方法互补。这些课题都是当今生命科学领域迫切希望看到的重要结构，任何一个结构的成功解析都将在国际生命科学界上引起巨大反响。参与本项目的清华大学、中国科学院生物物理所以及中国科学技术大学是我国结构生物学的研究中心。三个机构发挥各自优势，重点突破，同时又经常交流工作思路、经验教训，促进我国结构生物学的进步，尽快使我国的结构生物学研究达到世界领先水平，并培养出一批膜蛋白结构与功能研究的杰出人才。 2．技术路线 本项目以X-射线衍射晶体学为主、以计算生物学、NMR技术为辅，选择重点膜蛋白重组表达纯化进行结构生物学研究。在实验技术路线方面有以下几个特点及攻关重点： 真核膜蛋白的重组超量表达： 已知结构的真核生物膜蛋白绝大多数是体内蛋白（内源性蛋白）直接纯化结晶而来，这就大大限制了研究对象的选择范围。因此真核生物膜蛋白研究领域的一个重要攻关课题是如何构建合适的表达体系，将真核生物膜蛋白重组超量表达。迄今为止，真核生物中只有不足十个膜蛋白的结构来源于重组方法获得的蛋白，有趣的是，这些膜蛋白使用了三种不同的表达体系：a.昆虫细胞杆状病毒表达体系：GPCR（?-AR2）和ASIC就是从Sf-9昆虫细胞中超量表达而来。b.酵母表达体系：哺乳动物钾离子通道是第一个报道的由重组方法获得蛋白解析结构的真核生物膜蛋白，从Pichia pastoris中表达；LTC4合成酶则由两个研究组分别从Pichia pastoris以及Shizosaccharomyces pombe中表达。c.细菌表达体系：FLAP是唯一已知的由细菌表达的解出结构的人类膜蛋白。以上信息为我们重组超量表达蛋白提供了借鉴；除了构建尝试以上系统，我们还将尝试哺乳细胞表达系统、植物表达系统和体外转录翻译系统以期寻找最好的真核膜蛋白的重组表达系统，并为整个膜蛋白结构生物学领域提供新型表达系统。 真核膜蛋白纯化过程中最适去垢剂及磷脂添加剂的选择： 膜蛋白纯化结晶最关键的因素是去垢剂的选择。我们需要筛选大量的去垢剂以寻找最佳组合，并探索适合膜蛋白的磷脂添加剂。近年来，国际上开始出现一种同时使用多种去污剂以利膜蛋白结晶的方法，并有实验室尝试多种去污剂与磷脂添加剂混合使用；我们会系统研究如何合理选择不同的去污剂及磷脂添加剂以达到最佳效果。 适合真核膜蛋白的结晶方法： 迄今已知的膜蛋白结晶方法除了普通蛋白常用的悬滴法、坐滴法，还有一类专门适用于膜蛋白的Lipidic Cubic P