第二章基因工程的酶学基础解决方案.ppt

第四节 DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶 1. 来源 小牛胸腺。 2. 组成 大小两个亚基。 3. 特性 5’?3’DNA聚合酶活性 （terminal transferase） ② 不需要模板！ ① 需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。 ③ 底物可以是单链DNA、 是3’—OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 ④ 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 DNA 5’ 3’ TTT dTTP ，末端转移酶 4. 末端转移酶的用途 （1）同聚物加尾 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 外源DNA 载体DNA 5’ 3’ 5’ 3’ CCC CCC GGG GGG dGTP dCTP 末端转移酶 （2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。 AAGCTT TTCGAA 5’ 5’ HindⅢ酶切 A TTCGA AGCTT A Klenow补平 AAGCT TTCGA AGCTT TCGAA AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA 末端转移酶 dTTP AAA AAA 外源DNA （3）非放射性标记DNA片断的3’端 AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA AAA HindⅢ位点 HindⅢ位点 连接 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-1,1-dUTP等） 二、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ ATP T4多核苷酸激酶 如果ATP的?磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。 但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。 3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 （1）正向反应（forward reaction） （2）交换反应标记法 反应混合物中具有超量(?-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(?-32P)ATP的?-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP、ADP 多核苷酸激酶 反应效果不理想。 三、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性。 SDS中加热68oC可完全失活。 2. 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 碱性磷酸酶 3. 碱性磷酸酶的功能 （1）防止线性化的载体份子自我连接 单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。 AAGCTT TTCGAA HindⅢ酶切 A-OH TTCGA-P P-AGCTT HO-A 碱性磷酸酶 5’ 5’ 5’ A-OH TTCGA-OH HO-AGCTT HO-A OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。 但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。 A TTCGA AGCTT A AGCTT A A TTCGA 连接酶 -OH与-OH连不住 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 3’ P-AGCTT A-OH 5’ 3’ HO-A TTCGA-P 5’ 外源DNA 第五节 核酸外切酶（ Exonucleases） 是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 一、单链DNA外切酶 1.