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微生物限度检查法 验证实验要点及实例 标准化操作 方法选择 样品处理 冲洗方法和条件 中和剂加入 菌液加入 标准化操作 冲洗方法 强调少量多次：50ml/次； 强调充分振摇； 操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。 标准化操作 中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考虑其他步骤加入。 标准化操作 菌液加入 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。 滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液）。 标准化操作 菌液加入 而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。 验证实验的几个问题 微生物限度检查法验证实验要点 验证实验实例 微生物限度检查法验证实验要点 样品 菌种和实验用菌液（同无菌检查） 回收率测定实验 控制菌检查的验证 实验器材 首先应是合格的样品。 微生物限度检查样品 微生物限度检查样品 样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证 一般口服制剂验证大肠埃希菌 外用制剂验证金葡和铜绿假单胞 含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证 含动物组织（包括提取物）口服制剂验证沙门菌 阴道给药制剂（中成药）验证梭菌 抽样量和检验量分别单列一项。 抽样量 一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装）的3倍。 检验量 指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。 验证实验按检验量执行。 微生物限度检查样品 微生物限度检查样品 制剂形式多样，决定前处理各异 难溶固体制剂 非水溶性制剂 软膏、油膏 栓剂等 供试液的制备 制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。 7类供试品供试液的制备，其中增订： 微生物限度检查样品前处理 非水溶性供试品 ①司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80 ②供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加 45℃100ml pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，取水层作为1：10供试液。 微生物限度检查样品前处理 非水溶性膜剂供试品 化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取50 cm2，剪碎，加适量的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（50或100ml）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP 2000版规定:中药膜剂取30-50cm2 ，剪碎，加水100ml）。 微生物限度检查样品前处理 肠溶及结肠溶制剂 供试品10g，加100ml pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）,于45℃水浴振摇，使溶解。 微生物限度检查样品前处理 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温，并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。 微生物限度检查样品前处理 具抑菌活性的供试品 供试品接种至较大量的培养基中。1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查，可加大增菌培养基的用量，或采用薄膜过滤法。 离心集菌法 薄膜过滤法 微生物限度检查样品前处理 微生物限度检查样品前处理 目标是使不便于取样的供试品分散均匀！ 微生物限度检查法验证 细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证 定量——回收率测定实验 控制菌检查方法验证 定性——能否生长、专属性实验 在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。 回收率测定实验 验证用菌株 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。 菌液制备（同