第九章动物基因工程解决方案.pptVIP

9.1 转基因动物研究进展 　Go rdon 等(1980) 将重组DNA 用显微注射法导 入小鼠受精卵原核, 首次获得了整合有外源基因 的转基因小鼠, 此后的十几年中, 建立了许多整合 有外源基因的转基因小鼠和大鼠、转基因兔、 猪、羊、牛, 使得转基因动物这一技术在基础研 究和实际应用方面展示出良好的前景。 9.1.1　转基因动物的制作方法 9.1.1. 1　原核期胚胎的显微注射 9.1.1. 2　逆转录病毒载体感染发育早期的动 物胚胎 9.1.1. 3　精子载体法 9.1.1. 4　胚胎干细胞(ES)技术 9.1.1. 1　原核期胚胎的显微注射 该方法由美国人Go rdon(1980)发明, 是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。Go rdon 将SV 40的复制原点和启动子与疱疹病毒的TK 基因插入细菌质粒pBR322, 然后将之注入受精小鼠的原核, 并将经质粒注射后的胚胎植入假孕母鼠的输卵管。之后对出生的小鼠用Sou thern 印迹杂交法检测其基因组中是否含有注射基因的同源片段。在出生的78只小鼠中, 其中两只被认为是转基因阳性。由于条件的限制, Go rdon 当时并未得到活的转基因小鼠, 但这一伟大的尝试确证了外源基因可以通过这种方法整合到宿主基因组中, 从而为以后的研究工作开辟了一条崭新的途径。 继Go rdon 报道了显微注射法产生转基因小鼠之后, Palm iter(1982)年的报道在生命科学领域中引起了一场不小的轰动。Palm iter 将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I 基因启动子相连接, 然后将融合基因注入受精小鼠的雄原核, 生出21只小鼠, 其中7只为转基因阳性鼠。在阳性鼠中, 2号鼠在生后74天时, 体重达到同窝非转基因小鼠平均体重的1. 87倍, 这便是著名的“巨型小鼠”事件。Hamm er 等利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪。上述三起研究被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。 二氢叶酸还原酶基因选择系统 新霉素抗性选择系统 氯霉素乙酰转移酶基因检测系统 (1). 通过显微注射产生转基因小鼠的步骤 DNA的制备与纯化 超排卵、交配、卵的收集和培养 显微注射 假孕鼠的产生 卵的重新植入假孕鼠体内 DNA的制备与纯化 目的基因的克隆 目的基因的线性化 目的基因的纯化 超排卵、卵的收集和培养 超排卵:通过给雌鼠注射促性腺激素而增加其排卵量,每个雌鼠可回收20-30个卵。 配种：雌鼠和雄鼠交配，获得受精卵。 卵的收集:剖切输卵管释放卵团。 显微注射 注射时机：在雌前核与雄前核融合之前这段时间是注射的最佳时机。 显微注射： 假孕鼠的产生：将绝育的雄鼠(输精管结扎)与一可育的雌鼠交配。由于雄鼠不再产生 精子，却能刺激雌鼠的一系列妊娠反应，因此该雌鼠为假孕母鼠，是注射过基因的受精卵的养母。 卵的重新植入假孕鼠体内：输卵管或子宫移卵。 * 本章主要内容： 转基因动物研究进展 将基因转移入哺乳动物细胞 转基因小鼠 第九章 动物基因工程 9.2 动物细胞基因克隆和表达载体---SV40病毒 常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。 ① 20面体外壳： 由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。 5243bp的环状双链。 ② DNA： （1） SV40病毒的结构 SV40 猿猴细胞 细胞裂解 释放SV40 啮齿类细胞 细胞癌变 SV40DNA整合到寄主染色体上 permissive nonpermissive （2）SV40感染和生存方式 T-抗原（tumor antigen）: 两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。 随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。 (3) SV40 DNA的复制 ①解链 SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。 T抗原 SV40 DNA双链 ② SV40 复制起始位点 5’-CTCACTACTTCTGGAATAGC 3’-GAGTGATGAAGACCTTATCG 1 20 早期回文序列 TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCT AGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA 21 47 T抗原结合位点 GCATAAATAAAAAAAATTAGTC CGTATT TATTTT TTTTAATCAG 富含AT区 48 69 ①早期表达区： (4) SV40病毒的转录和翻译 编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。 ②晚期表达区： 在DNA复制一段时间后表达，产物是V