肌肌酸激酶_MB同功酶的克隆及原核表达.docVIP

人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达 李子颖，贾娟娟，刘一兵，韩世泉【摘要】 目的 构建人肌酸激酶MB同工酶的原核表达系统，纯化重组酶蛋白并检测其活性。方法 从购买的含CKM、CKB基因片段的质粒中扩增人肌酸激酶M、B亚基基因，构建pGEX-4T-1-CKMB E．coli BL21 (DE3)GST原核表达系统。以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白的GST标签亲和层析纯化。结果 重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期相符，诱导表达后细菌裂解液纯化后SDS—PAGE在分子量110,000（CKMB）处显示单一蛋白条带，采用酶联免疫分析的方法进行免疫活性实验，所得的蛋白和CKB、CKM抗体都有免疫结合。结论 成功表达并纯化了人肌酸激酶MB同工酶。 【关键词】：人肌酸激酶MB同工酶；原核细胞；基因表达 Cloning and expression of humn creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB) Li Zi-ying*, Jia Juan-juan, Liu Yi-bing, Han Shi-quan（*Atom HighTech Co., Ltd.， Beijing，102413 ，China） 【Abstract】 Objective To clone the whole gene of human creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB)express in prokaryotic cells, then purify recombinant CK-MB and determine its antigen-binding activity. Methods The CKM、CKB gene were amplified from plasmid we bought and insert into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with GST tag. The construct recombinant plasmid pGEX-4T-1-CKMB was transformed to E coli. BL21(DE3) for expression under induction of IPTG. The expressed fusion protein was purified by GST chromatography, then determined antigen-binding activity by ELISA. Results PCR、restriction analysis and sequencing proved that recombinant pGEX-4T-1-CKMB was constructed correctly. The expressed recombinant fusion protein with relative molecular mass 110 000 showed specific binding to policolonal antibody against CKM and CKB. Conclution The CK-MB was successfully expressed in prokaryotic cells and purified. [Key words] Humn creatine kinase-MB isoenzyme；Prokaryotic cells；Gene expression 急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)患者存活率的关键是早期快速诊断，因为心肌细胞在梗死6 h后通常不可逆转。对于诊断急性心肌梗死(AMI)，目前心肌标志物中的肌酸激酶(creatine kinase MB， CK-MB)质量被视为诊断急性心肌梗死较敏感的指标之一。 肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于心肌细胞中。急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞受损，膜的完整性和通透性改变，使细胞内的大分子逸出，能在外周血中被检测到。这些大分子物质被称为心肌损伤标志物。在这些心肌标志物中CK-MB是升高早，上升幅度大的一种酶，也是迄今为止诊断AMI最佳且临床上应用最广泛的血清酶指标之一。AMI后CK-MB于4 h升高，16～ 24 h达高峰 ，48～72 h恢复正常，其升高程度能较准确地反映梗死的范围，其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功。 目前CK-MB质量的检测是采用免疫分析的方法，需要使用大量高质量的标准品和抗体。由于人CK-MB天然来源的有限性，通过基因工程重组CK-