教学课件-流式解读.ppt

* * 正常人静止期体细胞有46条染色体，相当于7X10-12pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖期细胞则有着不同的DNA含量。在细胞周期（静止期G0，DNA合成前期G1，DNA合成期S，DNA合成后期G2，有丝分裂期M）的各个时期，DNA含量呈现周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；进入S期后，DNA的含量逐渐增加，介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为四倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。单纯从DNA含量无法区分G2和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入G0期，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，从细胞的DNA含量上，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M1期。一般情况下，大部分细胞处于G0/G1 期，而只有少数细胞处于S 或G2/M 期。 . 2N 峰对人来说指的是二倍体峰。 . 一些细胞发生突变后，它们的DNA 含量会发生改变。如果这种改 变比较明显并且可以测定出来的话，那么这些细胞就叫做异倍体 细胞。 DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。G2－M期DNA含量是G0－G1的两倍，而S期介于两者之间。 但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0－G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0－G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0－G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。 方法 1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 2．1ml PBS/FCS洗一次。 3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。 4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。 5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 6．400目的筛网过滤1次。 7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。 2）Annexin V/PI双染色法 1．细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，500～1000r/min离心5min弃去培养液。 2．用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。 3．用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。 4．500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。 5．加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。 用PI染色后通过DNA分析来检测凋亡是可以的，不过只有凋亡晚期的，而且结果误差比较大，还是annexin V检测凋亡更准确些，但在检测贴壁细胞时切记消化不可过度.DNA分析可以用流式自带的那个ModFit软件来进行的。在cellquest软件中，可以通过在Count-PI的直方图上划mark然后人工分析的 * 6 用机械法制成单细胞悬液， 调整浓度（2×10 个/ml), 用Annixin V法标记上机 三.实例解析 利用流式细胞术检测甘草多糖对小鼠S-180肉瘤的凋亡诱导作用，探讨中药甘草多糖的抑瘤作用 选取5组小鼠 3组为实验组 1组为空白对照组 1组为阳性对照组 接种肉瘤 给予3组不同浓度 的甘草多糖水 给予化疗药物 给予生理盐水 连续给药7日后取肿瘤 4、结果分析 通过试验可以得出，甘草多糖有明显的诱导凋亡作用，而且最小剂量组凋亡最高。证明低剂量甘草多糖通过诱导小鼠S-180肉瘤凋亡来抑制肿瘤生长；而阳性对照组杀伤肉瘤则是以导致细胞坏死为主。结果显示甘草多糖作为中药提取制剂用于治疗肿瘤可能有良好的前景。 几 点 提 示 1、流式细胞术参数的质量控制 流式细胞术标本从组织和细胞的获取，抗体的染色和洗涤，到利用流式细胞仪采集、存储和分析数据.并给出报告，牵涉到诸多步骤.每个步骤中均存在着不稳定和