生化-第10章DNA生物合成要点.pptVIP

* * * 2009年，诺贝尔医学与生理学奖 Elizabeth Helen Blackburn, 加州旧金山大学 * PBR322 质粒。 * Jack William Szostak，harvard Greider，John Hopkings University * 4. 导致DNA损伤的因素有那些，DNA如何修复？ 多数是自发性突变，是遗传进化的基础。 环境的理化因素诱导，如紫外线、化学诱导剂如亚硝酸盐等。 光修复：通过光复活酶, 修复嘧啶二聚体，广泛存在在于生物界, 但人类缺乏 切除修复：依靠特异内切核酸酶，识别损伤结构，并进行修复、合成和连接 重组修复: 依靠重组蛋白A, 先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口 SOS修复: DNA损伤广泛，难以继续复制时的一种应急修复。包括切除修复和重组修复，有多种酶和蛋白参与。特点：快而粗糙，错误率高，故而突变率高。 * * Rough strain, 无夹膜肺炎双球菌 smooth strain, 有夹膜双球菌。 * * 1953,Watson 和 Crick 提出DNA双螺旋结构，1962年获诺贝尔奖 * * * * 用大肠杆菌， N15同位素标记，SsCl浓度梯度离心 * * 真核生物线粒体DNA，两个复制起始点，两条链不同步启动 * * * 冈崎片段长度： 原核：1000-2000bp 真核：100-200bp * * * 3′→5′核酸外切酶活性,校对功能。 * * * * * * * 有些细菌由DNA聚合酶来合成引物 * * * * 紫外线照射，引起两个嘧啶碱基的共价聚合 * * SOS, 国际海难紧急呼救信号 * 1975年，诺贝尔奖 * 切除修复：依靠特异内切核酸酶，识别损伤结构，并进行修复、合成和连接。 重组修复: 依靠重组蛋白A, 先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口 SOS修复: DNA损伤广泛，难以继续复制时的一种应急修复。包括切除修复和重组修复，有多种酶和蛋白参与。 特点：快而粗糙，错误率高，故而突变率高。 逆转录作用 中心法则的重要补充 逆转录和逆转录酶的发现 实验现象： 1964年，Temin 等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒(ASV)等RNA肿瘤病毒所造成的感染 表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成DNA。 2. ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制 说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。 假说 DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物 这一过程大致为： RNA肿瘤病毒－DNA原病毒（或前病毒）－RNA肿瘤病毒。 1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶（reverse transcriptase） Howard Temin David Baltimore 逆转录的证明 逆转录病毒（retrovirus） 1. 定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。 所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。 2. 逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的 正链RNA分子组成，其5‘端有cap，3’端有ployA尾。 逆转录酶（reverse transcriptase） 定义：是RNA指导的DNA聚合酶。 具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和 RNase H的活性。 合成DNA的方向：逆转录酶合成DNA的方向为5’－3’。 合成DNA的引物： 不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。 一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp（色氨酸）为引物，鼠类逆转病毒则以宿主细胞tRNAPro （脯氨酸）为引物。 RNase H活性：是指逆转录酶可以从5’－3’和3’－5’两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。 逆转录 逆转录（reverse transcription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 逆转录是对中心法则的重要修正和补充！ RNA同样具有遗传信息的存储、传递和表达功能 逆转录作用图 逆转录原理的应用－RT-PCR 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-PCR）： 是将RNA的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。 RT-PCR过程 首先经反转录酶，以RNA为模板逆转录合成 cDNA。 然后以 cDNA 为模板，PCR扩增合成目的基因片段。 RT-PCR的用途 1. 检测细胞中基因表达