2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数例析.ppt

一、课题背景 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌等 课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 二、 研究思路： ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 1.实例： 启示：寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌能够生存。 PCR技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 ㈠.筛选菌株 方法：配制选择培养基 2.实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4·7H2O 2.1g Na2HPO4 1.4g KH2PO4 3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。 所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 4.培养基选择分解尿素的微生物的原理 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ㈡统计菌落数目： 2.活菌计数法 方法：稀释涂布平板法 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) M：稀释倍数 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值，需要设置重复组，即每一稀释度都至少涂布三个平板，经培养后，计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因：⑴土样不同 ⑵ 培养基混入了其他的含氮物质 ㈢.设置对照 三.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 ㈢.样品的稀释 ㈣.取样涂布 ◆如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 ㈤.微生物的培养与观察 课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 之后讲课本P22的最上面内容 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、内容 讲完后讲P23楷体字部分 知识小结: 微生物的实验室培养 培养基 类型： 成分： 液体培养基、固体培养基 水、碳源、氮源、无机盐 无菌技术 消毒： 灭菌： 制备培养基： 计算?称量?溶化?灭菌?倒平板 纯化大肠杆菌 平板划线法 稀释涂布平板法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、 化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法 6支试管，分别加入9ml无菌水 1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 a.系列稀释菌液： 菌液 a.系列稀释菌液： b.涂布平板： 稀释涂布平板法 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 取少量稀释液滴加到培养基表面 待酒精燃尽后冷却8～10s 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 培养24h后 培养： 将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 专题2 微生物的培养与应用 之后讲课本P22的最上面内容 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、