【2017年整理】实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶(实验报告).docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT1 生物化学实验报告 实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析 小麦幼苗过氧化物酶同工酶 一、研究背景及目的 电泳现象就是带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极泳动。电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，自此生物大分子的分离纯化便进入了电泳技术的新纪元。电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上又一次伟大的飞跃。人们清楚地意识到，要想使目标物得到分离，目标物与杂质之间的性质差异必须足够大，这又与某些性质差异小的物质的分离相矛盾，而人为放大这些差异小的性质必然会破坏目标物的原有结构，因此需要借助第三者进行差异转化，即以其自身的性质为基础，转化为其他方面差异大的性质。电泳技术就是利用一些生物大分子的电性特点，在一定的条件下使被分离物之间很小的差异转化为自身所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作用下便会体现出迁移方向及速度上的差异，通过时间上的积累进而体现为迁移距离的差异。最初的电泳技术是在溶液中进行的自由电泳，后来人们想到，由于待分离物的大小、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻力，这种阻力的差异又转化为了电场中迁移速度的差异，所以人们便发明了各种用于电泳的载体（支持介质），使分子的大小及形状差异得以转化和体现，大大提高了分辨率。至此，电泳技术的基本理论就建立了。此后，在实际操作中，人们不断进行探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为一项生物大分子分离纯化中令人瞩目的研究技术。 本实验基于电泳的基本原理对小麦过氧化物酶同工酶进行分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解一项新技术在实际应用中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两大技术各自的特点和优势。 二、原理[1] 1.过氧化物酶同工酶 同工酶是催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，测定同工酶在理论上和实践上都具有重要的意义。本实验测定的过氧化物酶同工酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物的光合、呼吸作用以及生长素的氧化等有关；在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定过氧化物酶同工酶的生物活性可以了解某一时期植物体内代谢的变化。 2.电泳的基本原理 带电粒子在电场中的泳动速度有以下公式： v= Eq6πγη 由此可以看出，粒子移动的速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电量成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。此外，粒子的移动速度还与形状有关，即非球形粒子（如线形DNA分子）在电泳中会受到更大的阻力。 不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，为了便于比较，常用泳动度或迁移率（m）来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下： m= vE = q6πγη 由上式可以看出，迁移率m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液粘度有关，而与电场强度无关。 又因为氨基酸、蛋白质、酶等的电离度α随着溶液pH的变化而变化，所以在实际点臃肿，常使用有效迁移率这个概念，有效迁移率（μ）定义为迁移率（m）和当时条件下电离度α的乘积。即： μ=m·α= q.α6πγη 3.聚丙烯酰胺凝胶的形成及特点 这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N，N-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵 （NH4）2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N，N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 4.凝胶系统及特点 本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦苗过氧化物酶同工酶，系统的不连续性表现在以下几个方面： （1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的凝胶孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH值不同，本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.3 的Tris-Gly 缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液