RedET重组技术的主要应用.pptVIP

③ “复制”上游引物，“新建”窗口，直接“粘贴”，“命名保存”。 ④下游引物：“junction marker”前20nt~25nt（引物） + “junction marker”后50nt（同源臂） ； ⑤ “复制”下游引物，“新建”窗口，“edit→Special past”，选择“Invert Sequence”，点击“OK”，命名“保存”。 同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998） 同源臂的长度在34～50bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的增加而增加。 2. 线性供体dsDNA底物的制备 选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用riplemaster、HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物； 纯化PCR产物： （1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高电转化效率。 降低模板对筛选工作带来的难度； （1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。 3. Red/ET重组系统的选择 “线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统； 根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。 质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp) 菌株： YZ2005 (recET) GBRed (redα?γrecA) GBDir (recET redγrecA) 4. 重组酶系统的诱导表达 1.5mL的Eppendorf管，做好相应标记，用无菌针头在盖子上戳一个洞，加入1.4mL含有相应抗生素的新鲜LB培养基 接种入40μL 过夜菌，30℃振荡培养2h，OD600≈0.2 加入诱导剂，37℃诱导40min： pBAD启动子：加入20μL 10％的L-阿拉伯糖进行诱导表达； pTet启动子：加入1.4μL 1μg/μL灭活四环素进行诱导表达。 * Red/ET同源重组技术的研究进展 胡胜标 2011年7月 内 容 二、 Red/ET同源重组技术的特点 三、 Red/ET重组的作用机制 四、 Red/ET重组中的功能元件 五、 Red/ET重组技术的主要应用 六、 Red/ET重组操作流程 七、 Red/ET重组新技术的发展 八、Red/ET重组在其他细菌中的应用 一、 什么是Red/ET同源重组 Red/ET同源重组：利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同源重组的方法。 Recombineering ( Recombination-mediated genetic engineering ) λ-mediated recombination ET cloning Recombinogenic engineering Nature Genetics (1998) Nature Biotechnology (2000) g b a l phage ET Rac phage Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用； recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶； recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白； redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片段的消化。 λ噬菌体的pL操纵子示意图 Single-strand annealing 3’ 5’ Strand invasion 3’ 5’ Digestion Binding Redb(RecT) Reda(RecE) Repair/Replication 限制性内切酶 连接酶 传统基因工程技术很难对BAC文库等大分子D