4、细菌内毒素检测程序.pptVIP

供试品溶液制备： 含2λ内毒素标准品的供试品溶液的制备： 取500U/ml的样品溶液1.0ml＋0.5EU/ml的内毒素标准品溶液1.0ml混合。 供试品 4000U/ml 1000U/ml 500U/ml 250U/ml 0.4ml 3.6ml 1.0ml 3.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 稀释10倍 稀释40倍 稀释80倍 稀释160倍 结果判断： 结果判断 样品管 阴性 对照 阳性 对照 样品阳性对照 符合规定 －－ －－ ＋＋ ＋＋ 不符合规定 ＋＋ －－ ＋＋ ＋＋ 需复试 ＋－ －－ ＋＋ ＋＋ 符合规定 －－－－ －－ ＋＋ ＋＋ 不符合规定 ＋－－－ －－ ＋＋ ＋＋ 三、操作注意事项 试验前准备： 1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。 洗净 去污去内毒素 去洗涤剂 精洗 除外源性热原：250 ℃干烤至少1小时。 2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后250 ℃干烤至少1小时。 3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。 实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。 实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。 2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。 振荡前 振荡后 内毒素分子在水溶液中的状态 3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。 4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。 5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。 6、恒温器的温度变化应1℃，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在（60±2）min，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。 7、使用的试管为10mm×75mm，10为试管外径。 结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。 干扰的类型： 抑制：供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性 增强：供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。 应使用适宜的方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的最简单、最有效的方法。 细菌内毒素检验 国家食品药品监督管理局 北京医疗器械质量监督检验中心 GB/T 14233.2 -2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法 2010年版《中国药典》细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法:利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。 一、概念及相关知识 热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。 热原：任何可以导致肌体发热的物质。 1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。 所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。 虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。 细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。 热原检查法：该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况来判定供试品中热原含量是否符合规定。 使用鲎试剂来检测细菌内毒素的方法为 细菌内毒素检查法（BET），是用来替代热原检查的一种方法。 鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。 细菌内毒素检查法 凝胶法 浊度法