gfp基因的克隆与表达.docVIP

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 姓名：刘会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（ Fluorescent Protein，FP）基因在大肠杆菌中表达。 通过分别将DH-5(pEGFP-N3)和DH-5(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-FP，将重组质粒 DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导FP基因表达，可以看到显现色，判断FP基因在大肠杆菌中成功克隆菌E.coli DH5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪 、电子天平 、台式离心机 、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器 、紫外灯、生物洁净工作台 、电热恒温水温箱琼脂糖凝胶电泳电泳装置凝胶成像酒精灯、培养皿、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、枪头 、离心管121 ℃ 高压灭菌20 min。（LB固体培养基LB中加琼脂粉至1 %） 溶液Ⅰ 50 m 葡萄糖 50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min0~4℃贮存 溶液Ⅱ 100 m NaOH 0.2 mol/L SDS 1% (W/V) 用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配； 溶液Ⅲ 100 m KOAc (5 mol/L) 60 mL 冰乙酸 11.5 mL H2O 28.5 mL 121 ℃高压灭菌 15 min0~4 ℃贮存 氯仿；琼脂糖10×酶切缓冲液TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶灭菌的0.1 mol/L CaCl2溴乙锭（EB）储存液 0.5 μgmL；LB/Kan（50 μg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇 ：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃DH-5α (pEGFP-N3)染色体DNA的提取 1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。 1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱 ⑵，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：4.1g?NaCl溶解于80ml?H2?O,缓慢加入10g?CTAB,加水至100ml其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%?乙醇，TE，10%?SDS，蛋白酶?K?(20mg/ml或粉剂)，5mol/L?NaCl。 生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。 1.2.5、实验步骤1.?100ml?细菌过夜培养液,?5000rpm离心10分钟,?去上清液。??2.?加9.5ml?TE悬浮沉淀,?并加0.5ml?10%?SDS,?50μl?20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶?K,?混匀,?37保温1小时。??3.?加1.5ml?5mol/L?NaCl,?混匀。??4.?加1.5ml?CTAB/NaCl溶液,?混匀,?65保温20分钟。??5.?用等