构巢曲霉在应答与金合欢醇诱导压力下蛋白质组学分析.docVIP

构巢曲霉在应答与金合欢醇诱导压力下蛋白质组学分析Asp-Pro-Arg (DPR)。烟曲霉中，这三个疏水蛋白类似蛋白最近被发现为压力保护元件。构巢曲霉蛋白DlpA在我们的蛋白组学研究中发现包括真菌疏水蛋白的模式特征。双向电泳显示，DlpA呈现出过早应答，直到大量增加出现稳定加上金合欢醇。3小时后达到最大。然后逐渐减少。如图2A。金合欢醇的一些立体异构体可以影响dlpA的表达，这表明这些物质对构巢曲霉的作用机制是相似的。 由于DlpA序列和植物和真菌的疏水蛋白相似，是否DplA具有疏水蛋白的功能。通过RNA印记分析，我们发现用1摩尔的山梨醇或者1摩尔的氯化钠渗透和低温诱导mRNA增加至一个稳定的水平。然而，除了细胞壁压力没有其他压力诱导则不显示很大的影响。此外，dlpA的mRNA在新形成的休眠分生孢子中保持一个较高的水平，但是在萌发时或是菌丝生长时会降低。 3、在构巢曲霉中dlpA反义RNA的表达 为了分析DlpA对于构巢曲霉抵抗金合欢醇的作用，于是进行了基因敲除。敲除菌株的特征呈现出令人费解的特征，我们的理解是基因敲除诱导假定的补偿机制。值得一提的是敲除菌株表现出菌落直径变小和野生型菌株相比。这个表型能够在渗透压或三十度下培养的情况下得到部分改善。在低于20摄氏度的情况下变现出比野生型生长更好的态势，在42摄氏度的情况下没有明显的生长不足出现。敲除菌株没有表现出对金合欢醇的敏感性，可能的机制抑制DlpA的功能，也就是掩盖金合欢醇毒性的机制。将dlpA的反义RNA转化到野生型R21中，用DNA杂交检测到反义RNA的存在。在野生型菌株中dlpA基因有微弱的表达在加入盐酸强力毒素后的三十分钟，但是在之后的时间里就没有表达了。但是，用浓缩的盐酸强力毒素对野生型R21的生长没有什么明显的生长，然而与没有毒素的情况下相比孢子形成作用减少了百分之六十。金合欢醇的存在导致有反义RNA菌株完全失去孢子形成作用，但是不影响菌落直径生长，和dlpA敲除菌株一样。但是，有反义RNA诱导的菌株在抗真菌毒素的情况下损害更大。 4、在休眠分生孢子中DlpA的功能和调控 在休眠分生孢子中高水平DlpA基因的敲除显示在这个阶段起一个非常重要的通讯蛋白的作用。由于在有渗透压的情况下dlpA基因高表达，所以我们分析它的调控也在渗透压控制MAP激酶途径。为了这个目的，突变株缺乏HogA MAP激酶和敲除突变菌株在正常压力下的应答调控因子AtfA，是Hog途径的一个下游组分，在100微摩尔金合欢醇的条件下30分钟发生改变。RNA印记分析显示缺乏金合欢醇诱导可以使dlpA基因表达在atfA和hogA删除的菌株中。这个结果表明，HogA MAP激酶途径参与dlpA基因的表达调控。 5、DlpA是杂色曲霉素生物合成所必须的 在液体培养基中培养三天，上层漂浮物和dlpA突变菌株的菌丝着色与野生型相比较浅。为了验证是否dlpA基因的敲除减少了色素的产生或者其他的次生代谢产物，我们做了HPLC分析，结果令人吃惊的是基因的敲除不能产生次生代谢产物杂色曲霉素在实验条件下，然而，另外一种次生代谢产物terrequinone A却可以检测到doxycycline的处理下也很难检测到杂色曲霉素(stcU, stcE and aflR)的mRNA表达水平，结果显示和构巢曲霉的野生型和没有用doxycycline处理的存在反义RNA的菌株这三个基因的表达量很大程度的下降与之相似的Blast分析显示烟曲霉中dlpA和构巢曲霉中dlpA同源。 尽管在构巢曲霉中的疏水蛋白基因的敲除是不致死的，我们发现DlpA在抵抗外界压力方便起着非常重要的作用。值得注意的是，两个菌株杂色曲霉素的产生都不足。这表明改变的PkaA活力水平在存在反义RNA的菌株中下游的激活因子，直到杂色曲霉素生物合成受到抑制在实验条件下。然而，在自然产生的正负调节因子生物合成之间的相互作用不是完全的清楚。可能的在真菌细胞中，疏水蛋白DlpA拥有更多普遍的功能。基于DlpA对于卡泊芬净的敏感性增加了，DlpA 可能对细胞壁的稳定性起作用。相比较，DlpA敲除菌和存在反义RNA的菌株都没有表现对其他细胞壁干扰素有很高的敏感性。所以，更可能的是DlpA和压力影响的蛋白相互作用包括膜相关的信号组分等。值得注意的是他与烟曲霉中具有相似功能的疏水蛋白之间的关系。研究表明在烟曲霉中Rho1和Rho3两个家族的GTP酶受金合欢醇的影响。直到Rho GTP酶发现为细胞骨架动力蛋白的调节子，表明它们在细胞壁开始压力下错位，导致细胞骨架的改变和最后菌丝顶端的膨大。这就引起推测疏水蛋白参与这个机制，直到Rho1表现出和β-1,3葡聚糖合成酶复合体相互作用DlpA 基因的敲除导致分生孢子对氧化和温度压力的敏感性增加，潜在的疏水蛋白相似蛋白可以让