1 血清疫球蛋白IgG提取.pptVIP

实验一 血清免疫球蛋白IgG的提取 目的 掌握血清免疫球蛋白IgG提取原理； 熟悉血清免疫球蛋白IgG提取操作过程和方法 原 理 IgG是血清中主要的免疫球蛋白，占全部抗体含量的70％－75％，在临床免疫学检验技术中常用到的第二抗体就是通过用纯化人IgG作抗原免疫动物而来 分离纯化IgG的技术有多种，通常采用综合技术，其中盐析沉淀法常用于IgG的粗制品的提取 原理 蛋白质颗粒在水溶液中 亲水胶体 蛋白质颗粒在盐溶液中 既不含水膜又不带电荷的不稳定颗粒  原理 蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清免疫球蛋白主要为γ－球蛋白，它在一定浓度中性盐溶液中易于沉淀，而其他蛋白质组分在此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。 材料 样本 正常人血清 试剂 生理盐水、饱和硫酸铵溶液、 透析缓冲液 主要器材 离心机 冰箱 透析袋 紫外分光光度计等 操作步骤 1.25ML血清＋1.25ML生理盐水 滴加饱和硫酸铵溶液2.5ML 注意事项 蛋白质的浓度、盐的浓度、PH值、温度对盐析的效果有影响 饱和硫酸铵溶液的滴加方式 盐析后放置时间、离心操作的速度、时间 透析袋的使用 方法评价 硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质变性，操作简单，为盐析中常用的中性盐 硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓冲能力差，故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经过凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析进一步提纯 结果判断 效价可用免疫双扩散试验判断 特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察 思考题 盐析法提取免疫球蛋白的实验原理？ 盐析法提取免疫球蛋白时，主要的影响因素有哪些？ * * 弃去上清液（含清蛋白） 沉淀溶于生理盐水,使体积达1.25ML 滴加饱和硫酸铵溶液0.625ML 弃去上清液（α、β球蛋白） 沉淀（γ球蛋白及少量β球蛋白） 上清液（β球蛋白） 沉淀为γ球蛋白 室温静置30min, 离心4000rpm,10min 重复一遍 紫外分光光的计测定蛋白含量 沉淀放入透析袋， 充分透析，去除NH4+ 室温静置30min, 离心4000rpm,10min