PCR技术全解.ppt

内容 第一节 PCR技术的基本原理 第二节 PCR反应体系中的各 种组分分析 第三节 PCR技术的分类 第四节 PCR技术的应用 第五节 DNA分子标记 基因克隆 目的基因的分离和制备 PCR Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 PCR的最早设想 ： 1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 ：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。 1985年公开报道 PCR 1987年PCR得到美国的专利权 1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一 1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖 第一节 PCR技术的基本原理 一、PCR技术的基本原理 二、PCR扩增过程 三、PCR技术的特点 一、 PCR技术的基本原理 依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNA pol的作用下合成新生的DNA互补链。 二、PCR扩增过程 1、高温变性 在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA 变性温度： 94—97℃，常95 ℃ 30—50s，常30s 2、低温退火 当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物于其互补的模板在局部形成杂交链。 退火温度： 25—60℃，常55℃ 60—90s，常60s 3、适温延伸 在DNA pol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应 延伸温度： 70—74℃，常72℃ 60—120s PCR原理 PCR的反应动力学 理论上为2n。 30次循环，DNA产量达109拷贝 实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75% 30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝 三、PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品的广泛性 高度的敏感性 可将极微量（pg级）DNA扩增到紫外光下可见的水平（μg级） 从100万个细胞中检出一个靶细胞； 在细菌学中最小检出率为3个细菌 对单拷贝基因、单根头发、一滴血等微量标本进行分析 高度的特异性 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 高度的特异性 PCR扩增的特异性依赖于两个引物的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性 只要引物设计合理、反应温度适宜，PCR的特异性是相当高的 操作简便快速 PCR仪 1-2小时或数小时 扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广 PCR仪生产厂家 中国科学院遗传研究所 复旦大学 北京市应用新技术研究所 美国Perkin Elmer公司的TC1、480、9600 瑞典Pharmacia公司的Gene ATAGTM PCR PCR仪种类 机械手臂式（转移式）PCR 变温式（固定式）PCR PCR仪 半导体式全自动PCR仪 适用样品的广泛性 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 可以DNA或RNA，纯化的或粗制的；新鲜组织或陈旧样品；细胞或体液；完整大分子或部分降解的DNA 第二节 PCR反应体系中的各组分分析 一、引物 二、DNA pol 三、DNA模板 四、dNTPs 五、PCR反应的缓冲液 六、Mg2+ 七、 PCR反应条件的选择 八、标准的PCR反应体系 一、引物 引物的设计决定PCR反应的成败 PCR的效率和特异性取决于： 1、引物与模板的特异结合 2、聚合酶对引物的有效延伸 引物设计原则 1、引物长度以16-30为宜 引物过短，特异性降低 引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度 若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点 若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。 引物设计原则 2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 4、碱基分布的随机性