实验4蛋白质的颜色反应和沉淀反应解析.pptVIP

实验四 蛋白质的颜色反应和沉淀反应 目的： 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 2. 原理： 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 I. 蛋白质的颜色反应 A.双缩脲反应 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用湿润红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1ml 混匀， 1%CuSO4溶液2滴，观察有无紫色出现。 另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察 。 B.黄色反应 在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液10滴，观察颜色反应。 C.茚三酮反应 取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。 注意：1） 此反应必须在pH5～7进行； 2）加热注意安全，管口禁止朝人！ II. 蛋白质的沉淀反应 1. 目的： 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。  了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。  了解蛋白质变性与沉淀的关系。 2. 原理： 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。  A.蛋白质盐析作用 取蛋白质溶液3 ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（50%饱和浓度），微微摇动试管，使溶液混合静置5 min，此时析出的为球蛋白； 将上述混合液过滤，滤液中加入约一药匙硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 B.乙醇沉淀蛋白质 取蛋白质溶液1 ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2 ml混匀。观察有无沉淀析出。 C.重金属盐沉淀蛋白质 取试管2支各加蛋白质溶液2 ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。 乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。 蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。 D.生物碱试剂沉淀蛋白质 植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团的缘故。 取试管2支各加蛋白质溶液2 ml及1%醋酸溶液4-5滴，向一管内滴加5%鞣酸溶液数滴，另一管内滴加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。 将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm 处比色，定量测定蛋白质。 * 含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。 * 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。 * * 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂