实验四 花粉采集及生命力的测定解析.pptVIP

实验四 花粉贮藏及花粉生活力的测定 花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便对杂交结果进行分析与研究。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术 。（为什么贮藏花粉？） 一、实验目的 掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。 二、实验材料 月季、百合、一串红、矮牵牛、油茶等植物的花粉。 三、仪器及药品 载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、毛笔、干燥器、小指形管、标签、记号笔、显微镜、天平、烧杯、培养皿、滴管、玻璃棒、量筒、电炉、石棉网、 冰箱； 凡士林、无水氯化钙、蔗糖、琼脂、蒸馏水、硼酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碘、碘化钾、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。 四、实验原理 花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。 花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过氧化物酶、脱氢酶的活性高低（呼吸）、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。 鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种： 1 ．直接测定法 ： 将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。 2 ．形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 3 ．染色观察法 （对二萘氧基联苯胺） （1）过氧化物酶测定法 原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力。 步骤和方法：先在载玻片上加少量待测花粉，然后在花粉上滴试剂Ⅰ和试剂Ⅱ各一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经3～4分钟后，再放在显微镜下检查，有生活力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色，为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。 3 ．染色观察法 （2）碘-碘化钾染色法 原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。 步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。 3 ．染色观察法 （3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法 原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲（TTF）而呈红色。 步骤和方法：取少量花粉放在载玻片上，在花粉上滴1～2滴TTC溶液，用镊子使其混匀后，盖上盖玻片。将此载玻片上置于恒温箱中（35～40℃）约15～20分钟，在显微镜（100倍）下观察。凡有生活力的花粉粒呈红色，其次呈淡红色，失去生活力的和不育的花粉粒表现无色。 4 ．培养基发芽法 在培养基上进行花粉的人工萌发，鉴定待测花粉萌发率的高低。此法若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异，所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。 五、实验步骤： １．花粉的贮藏 （１）将采集的花粉进行干燥（凉干或放入盛有无水氯化钙的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏结为度。 （２）将干燥的花粉装在指形管中（不要太多，一般以五分之一体积或更少为宜），瓶口塞以纱布，瓶外贴以标签，注明花粉种类、采收日期。 （３）将指形管放入无水氯化钙控制一定湿度的干燥器中，干燥器置于0 ～ 2℃ 的冰箱内。 ２．花粉生活力的测定： （１）染色观察法 ——TTC 和KI染色法 ①　 分别配制 TTC 和KI染色液各100ml，装入棕色瓶中备用。 ②　 制片：取少量花粉于载玻片