第01章 形态学检验技术幻灯片.pptVIP

投射电镜制样技术 STM是利用直径为原子尺度的尖锐探针扫描样品表面，并测定流过探针的隧道电流得到超高分辨的三维图像。 成像过程中探针与样品表面之间的距离小于1nm，电子云互相重叠，在这两物体间施加2mv~2v的电压，电子就可因量子隧道效应有针尖（或样品）转移到样品（或针尖），从而在针尖和样品间形成隧道电流。 STM横向分辨率为0.1~0.2nm，深度分辨能力为0.001nm，放大倍数可以达到数千万倍。 克服了电子显微镜中高能电子束对样品的辐射损伤以及样品必须处于高真空中的限制。 STM可以在超高真空、高真空，也可以在大气下甚至液体中无损伤的直接观察样品表面结构。 * 样品上需要照明的区域大小与放大倍数有关。放大倍数愈高，照明区域愈小，相应地要求以更细的电子束照明样品。由电子枪直接发射出的电子束的束斑尺寸较大，相干性也较差。为了更有效地利用这些电子，获得亮度高、相干性好的照明电子束以满足透射电镜在不同放大倍数下的需要，由电子枪子枪发射出来的电子束还需要进一步会聚，提供束斑尺寸不同、近似平行的照明束。这个任务通常由两个被叫做聚光镜的电磁透镜完成。图1-5中C1和C2分别表示第一聚光镜和第二聚光镜。C1通常保持不变，其作用是将电子枪的交叉点成一缩小的像，使其尺寸缩小一个数量级以上。此外，在照明系统中还安装有束倾斜装置，可以很方便地使电子束在2°～3°的范围内倾斜，以便以某些特定的倾斜角度照明样品。 3.4 显微镜的使用操作及注意事项 (1)观察前的准备 (2)低倍镜观察 (3)高倍镜观察 (4)油镜观察 3.5 微生物涂片、染色的检验技术 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。 常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 操作步骤： ①涂片→②干燥→ ③固定→ ④染色→ ⑤水洗→ ⑥干燥→ ⑦镜检 3.6 显微制片技术 一般可分为非切片法与切片法两大类： 非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等； 切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。 应用最广泛的石蜡切片法制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。 (1)取材和固定 固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块，组织块的大小以厚度不超过５mm?为宜，并快速投入固定液中。固定时间为数小时至２４小时（需视组织块的大小而定）。 (2)冲洗 经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色。一些固定液固定的材料，可直接移入70％酒精中，多换几次酒精，直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无妨碍。浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于７０％酒精中。 (3)脱水 柔软并含有多量水分的组织不易切成薄片，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。 常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经70％酒精→80％酒精→95％酒精第一次→95％酒精第二次→无水酒精第一次→无水酒精第二次，各级酒精1-2小时。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。 (4)透明 酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。 将脱水后的材料经1：1无水酒精与二甲苯→二甲苯第一次→二甲苯第二次，各级时间为0.5-2小时，务使组织达到透明为止。 (5)浸蜡 将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切