3色谱-毛细管电泳法分解.ppt

第三章 毛细管电泳法 姚彤炜 概述 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳 (HPCE)，是80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳技术与层析技术相结合的产物 广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药物及代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选择性上与高效液相法有很大的互补性 被多国药典收载，如2010年版中国药典对盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检查，USP对盐酸罗哌卡因的对映体纯度检查，均采用毛细管电泳法测定 一、基本原理 高效毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类技术 在毛细管电泳中有两个重要的迁移： 电泳迁移 电渗流迁移 电泳迁移 在电场作用下，带电组分作定向移动。其迁移速度（?）可用下式表示： ? = ?eE （1） ?e为电泳淌度 E为电场强度（V/L）——是外加电压和毛细管长度的函数 电泳迁移原理 对于给定的离子和介质，淌度?e为离子的特征常数，其大小取决于分子所受的电场力FE和其通过介质时的摩擦力FF的平衡： FE = qE （q为离子电量） FF= －6??r? （? 溶液粘度, r 离子半径, ? 离子速度） 达到平衡时，两种力大小相等而方向相反，即 qE =6??r? （2） 电泳迁移原理 根据式(1) ?=?eE ，淌度?e=?/E 根据式(2) qE=6??r?，?/E =q/(6??r) 所以 ?e= q/(6??r ) （3） 式（3）表明，带电量大的物质，离子半径小的物质有较高的淌度 淌度 淌度——物理常数，是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀释条件下的数值，即绝对淌度 有效淌度——实验条件下测得的数值，其取决于操作缓冲液的pH值和组成 溶液pH值对淌度的影响 若两种溶质在完全离子化状态下，具有相同的电泳淌度，则因没有差速迁移而不能分离 但若它们具有不同的pKa值，则可调节溶液pH值，使他们具有不同的有效淌度，而达到分离的目的 电渗流（EOF） 毛细管电泳中的一个重要现象，是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体整体流动的现象，是推动流体前进的驱动力 当固体与液体接触时，固-液两相界面上会带有相反符号的电荷，形成双电层。对于石英毛细管柱，当溶液pH值达4以上时，其内壁带负电荷，管中液体将感应一层正电荷，形成双电层，在高电压作用下缓冲液整体向负极移动，此即电渗流(?eof) 电渗流作用示意图 电渗流性质 电渗流的一个独特性质是其具有平面流型，推动液体流动的力在毛细管内均匀分布，平面流型的优点是对谱带的扩散没有直接作用 带电微粒在毛细管内的移动的速度 带电微粒在毛细管内的移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。? = (?e + ?eof）V/L 一般情况下，电渗流的方向是由正极向负极移动，而电渗流的速度又远大于电泳流 淌度与迁移时间 式中L为毛细管总长度， l为毛细管有效长度（进样点到检测器距离），V为电压 当L， l， V一定时， Tm与?e成反比 电渗流后的迁移时间 Tm=L·l/（ ?e + ?eof ）·V （?e + ?eof ）称为表观淌度?a（即在电渗流存在下测得的淌度） 溶质从进样点迁移至检测点所用的时间称为“迁移时间(t)”，根据上式可计算溶质的表观淌度： ?a =?e＋ ?eof = L·l/t·V 当L、l、V一定时， ?a与 t 成反比 二、分离度与理论板数 分离度R = Z / 4 ? （Z为两峰间距，?为峰标准差） 理想条件下理论板数n与电压V的关系可表示为： N=（ ?e＋ ?eof）· V·l / 2DL（式中D为扩散系数） D值小的大分子扩散小，柱效高 在高电场下(V值大)，溶质在毛细管内停留时间短，扩散小， 柱效高 影响分离效率的因素 焦耳热与温度梯度——电流通过而产生的热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、外加电压等影响 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化2%～3% →淌度变化2%～3% 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞长度非常重要。对进样长度的限制是低于毛细管总长度的（1～2）%。例 70cm长的毛细管，进样量应小于7mm 影响分离效率的因素 溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖尾或发生对溶质的完全吸附。对多肽和蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采用多种方法来减少相互作用： 增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷 在极端pH值下进行分离，使石英表面硅羟基以不带电的形式存在 对毛细管壁进行涂层处理 电分散作用——样品区带与操作缓冲液的电导差异可产生峰型畸变 样品与缓冲液电导不匹配引起的电分散 三、分离模式 毛细管电泳的操作方式有多种，分离机