中国生物程杂志 China Biotechnology Vol25 No10 2005.docVIP

中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(10):1～6 研究报告 Th表位修饰的BLyS突变体的构建及活性分析* 高会广1,2府伟灵2 李蓉芬1 陈麟凤1邢效如1张艳1何凤田1** （1 第三军医大学西南医院检验科重庆4000382 第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室重庆400038） 摘要在已克隆可溶性BLyS（sBLyS）cDNA的基础上，经PCR构建了其缺失不同区域的突变体（msBLyS）cDNA，然后将msBLyS cDNA与卵清蛋白（ovalbumin，OVA）Th表位DNA序列重组，测序正确后分别克隆于原核表达载体pQE80L，并转化E.coli DH5α，经IPTG诱导后，融合蛋白以包涵体的形式表达，表达量均在菌体总蛋白的30%以上。包涵体经洗涤、溶解并经NiNTA层析纯化后，目的蛋白的纯度均在90%以上。活性检测发现，所获重组蛋白均丧失了sBLyS所具有的生物学功能，这些工作的完成为进一步探讨其治疗作用打下了基础。 关键词B淋巴细胞刺激因子突变体活性分析 收稿日期：20050118修回日期：20050425 *国家自然科学基金资助项目30400187 ** 通讯作者，电子信箱：hefengtian66@B淋巴细胞刺激因子（Blymphocyte stimulator, BLyS）也称为THANK(TNF homologue that activates apoptosis, NFκB and JNK)、TALL1(TNF and apoptosis ligandrelated leukocyte expressed ligand 1)、BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)、zTNF4等，是TNF家族的一个新成员［1,2］。研究发现，BLyS过表达参与了多种自身免疫性疾病和B细胞恶性病的发生和发展［3~7］。并已证实，用抗BLyS抗体或其可溶性受体抑制BLyS的功能可缓解相关疾病的症状［8~10］。但这些抑制分子仍有许多不足之处。 Dalum等［11］提出了注射异源性Th表位修饰的重组TNFα蛋白而长期产生抗TNFα抗体反应的新方法，证实了此法的安全和可行性。本研究将异源性Th表位与sBLyS突变体（mutant sBAFF）重组，构建BLyS的免疫抑制分子，为进一步探讨其治疗作用打下基础。 1材料和方法1.1材料 质粒pUC19sBLyS(含BLyS134285 cDNA)由本室构建并保存，pQE80L、 DH5α菌种和Raji细胞由本室保存；PCR纯化试剂盒购自Promega公司；Pyrobest DNA 聚合酶、限制性内切酶及T4连接酶购自大连宝生物工程有限公司；抗His单抗和NiNTA层析系统购自德国Qiagen公司；羊抗小鼠IgGHRP购自北京中山生物技术有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司。 1.2方法 1.2.1OVA Th表位DNA序列的设计和合成OVA Th表位DNA序列共27bp，根据GenBank报道的编码卵清蛋白（ovalbumin，OVA）325333的DNA序列设计了2对全合成序列，分别用来替换sBLyS 5′末端或sBLyS 3′末端部分DNA序列，并在序列的5′端和3′端引入了酶切位点。这些序列由上海生工公司合成。 用于替换sBLyS 5′末端序列的OVA Th表位DNA全合成序列如下： 5′GA TCC ATG CAA GCT GTC CAT GCA GCA CAT GCA GAA GGT AC3′ BamHIKpn I 5＇C TTC TGC ATG TGC TGC ATG GAC AGC TTG CAT G 3′ 用于替换sBLyS 3′末端序列的OVA Th表位DNA全合成序列（引入了终止密码子TGA）如下： 5′C CAA GCT GTC CAT GCA GCA CAT GCA GAA TGA A 3′ 5′AG CTT TCA TTC TGC ATG TGC TGC ATG GAC AGC TTG GGT AC3′ HindIIIKpn I 2005, 25(10)高会广 等：Th表位修饰的BLyS突变体的构建及活性分析 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.10 2005 1.2.2缺失突变体cDNA的扩增PCR引物根据pUC19sBLyS序列设计并由上海生工公司合成，采用反向PCR从pUC19sBLyS质粒扩增目的片段（包含pUC19和msBLyS的DNA序列，大小约2700bp）。下