藻类叶绿素a的测定参考资料.docVIP

藻类叶绿素a的测定 一、实验名称 藻类叶绿素a的测定 二、实验目的——(水)环境化学中叶绿素a测定意义 在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。同时，叶绿素a也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一叶绿素据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A =α?C?L 式中：α为比例常数。当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。已知叶绿素a的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm，已知在波长663nm下，叶绿素a在该溶液中的比吸收系数分别为82.04已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，根据经验公式便可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。 已知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca +9.27Cb………………(1) A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2) 式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。 解联立方程(1)、(2)可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3) Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4) 如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为： Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5) Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6) 叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7) 叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5×CT 由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为34.5)，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量： CT(g/L)=A652/34.5 CT(mg/L)=A652×1000/34.5………(8) 因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。 从上可见，叶绿素提取后测定又可以分为两种：单色法(663nm)与三色法(645nm、663nm、652nm)。在标准方法、超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法等多种常见浮游植物叶绿素a测定方法中，针对实验室培养的微囊藻（Microcystis aeruginosa）水华样品为研究对象进行的叶绿素a含量测定。不管是从叶绿素a提取的完全性、测定数据的稳定性、试验操作的简便性考虑等方面来看，包括国家标准方法在内的大多数方法，存在操作耗时长、过程复杂、叶绿素提取不完全的缺点；而以丙酮加热法测量叶绿素a的提取效率高、数据稳定性好，操作耗时短、简便，可推荐作为一种常用的浮游植物叶绿素a的测量方法，尤其是应急监测或大批量水环境样品测定时更显现优势()。 表1 不同提取方法实验耗时情况测定方法 标准方法 延时提取法 热丙酮法 反复冻融法 超声提取法 丙酮加热法 热乙醇法 混合溶剂法 ρ/(μg·L-1) 0.974 1.011 1.216 1.435 1.517 1.635 1.026 1.397 标准方差 0.149 0.163 0.157 0.064 0.253 0.072 0.077 0.126 变异系数 15.7 16.0 14.7 3.91 16.5 3.26 5.24 9.42 实验耗时/h 8-8.5 7-7.5 9-9.5 24 21 1.5-2 8-9 8-9 丙酮加热法测定的注意事项：随着水浴加热过程温度的升高，丙酮的萃取能力得到增强，而且提取过程耗时短、操作简单，样品基本没有损失。但在实验过程中，加热的时间与温度控制很重要，且需要采取避光措施。温度过高、有光照条件以及加热时间过长，均可能破坏叶绿素a的稳定性。 仪器设备：5mL或1mL移液枪、5mL或1mL枪头、10mL离心管、离心机、锡箔纸、水浴锅、温度计、10mL刻度试管、比色皿、分光光