微生态菌种检测标准分解.docVIP

丁酸梭状芽孢杆菌检测方法 A1 范围 生产分析和质量控制部门适用 A2 原理 丁酸梭状芽孢杆菌为生芽孢严格厌氧菌，其芽孢能抗高热（在100℃下30min仍能存活），，其芽孢为椭圆或长桶形，0.6～0.9×1.0～1.5μm。与芽孢囊中央或近中央部形成，一般于腰间发芽。营养细胞纺锤形(梭状)0.3～0.7×2～3μm，孤立或成短链，杆端半圆形。革兰氏阳性。 A3 试验方法 A3.1 仪器设备和材料 A3.1.1 冰箱0-4℃ A3.1.2 配有镜台测微尺和目镜测微尺的生物显微镜镜（10×100） A3.1.3 恒温培养箱 A3.1.4 恒温干燥箱 A3.1.5 恒温摇床 A3.1.6 灭菌锅 A3.1.7 无菌室或超净工作台 A3.1.8 厌氧罐（5L或10L） A3.1.9 架盘药物天平：0～500g，精精度至0.5g A3.1.10 试管：Ф15mm×150mm Ф18mm×180mm A3.1.11 灭菌培养皿：直径9cm A3.1.12 三角瓶：500ml A3.1.13 无菌吸管：1ml(具有0.01ml刻度) 5ml，10ml（具有0.1ml刻度） A3.1.14 玻璃刮刀或L型玻璃棒（涂布棒） A3.1.15 灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和剪刀 A3.1.16 酒精灯 A3.1.17 载玻片 A3.1.18 镊子 A3.1.19 接种环、接种针 A3.1.20 均质器或微型振荡箱 A3.2 培养基和试剂 A3.2.1 除特别注明外，试验中所以试剂为分析纯试剂，水为蒸馏水或相应程度的水，溶液为水溶液。 A3.2.2 营养肉汁（琼脂）培养基（配置方法见附录B1） A3.2.3 7%NaCl耐盐试验培养基（配置方法见附录B2） A3.2.4 厌氧培养基（配置方法见附录B3） A3.2.5 丙二酸盐培养基（配置方法见附录B4） A3.2.6 革兰氏染色液（配置方法见附录B5） A3.2.7 0.85%灭菌生理盐水（配置方法见附录B6） A3.2.8 V-P试剂（配置方法见附录B7） A3.2.9 3%-10%H2O2溶液 A4 丁酸梭状芽孢杆菌菌落数检测 A4.1 检验程序 检 样 ↓ 用无菌生理盐水做成几个适当倍数稀释液 ↓ 选择2-3个适当稀释度各0.1ml，涂布于富集培养基平皿 ↓ 置于厌氧罐中,36±1℃ 培 养24-72小 时 ↓ 菌 种 鉴 别 检 验 ↓ 菌 落 计 数 ↓ 报 告 A4.2操作步骤 A4.2.1采样 A4.2.1.1采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。取样按本标准规定的取样方法。 A4.2.2梯度稀释 A4.2.2.1以无菌操作经过充分摇匀的待检样25克移入含有225毫升灭菌生理盐水（按本标准附录B6规定执行）和带玻璃珠的灭菌三角瓶内，并于振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟，做成1:10的均匀稀释液，混合均匀。 A4.2.2.2 取1:10稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌生理盐水和带玻璃珠的灭菌三角瓶中，并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟，充分摇匀制成1:100的稀释液。 A4.2.2.3 取1:100稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌生理盐水试管中，并于微型震荡器上8000-10000转/分钟处理2-3分钟后进行10倍梯度稀释。每个稀释度换用一支1.0ml灭菌移液管，按上述操作程序进行10倍稀释直至108 A4.2.3涂布接种 估计样品的含菌量，选择三个合适连续稀释梯度，分别再作10倍稀释的同时，各取0.1ml分别加入到计数培养基（营养肉汁琼脂培养基，按照附录B1规定执行）平皿，均匀涂布，各个稀释梯度做三个平皿，同时做灭菌生理盐水空白对照。以上操作需在20min内完成。将平板倒置于厌氧罐中，并于35±1℃的恒温培养箱中培养。 A4.2.4 菌落观察计数与镜检 A4.2.4.1 培养8小时后开始记录出现菌落的时间，24小时后记录观察到的菌落特征,选取菌落数在30-300之间的平板进行菌落计数。每一稀释梯度采用三个平板的菌落平均数，以无片状菌落生长的平板作为该稀释梯度的菌落数，有较大片状菌落生长时，则不宜采用，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落又分布很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全平板菌落数。 A4.2.4.2 稀释梯度的选择 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释梯度，乘以稀释倍数报告之。 如有两个稀释梯度，其生长的菌落数均在30-300之间，视两者之比如何来决定，如其比值小于2，报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字。 如所