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重组子的筛选 生物与食品工程学院 重组子的筛选 并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组DNA的克隆子，必需利用载体、宿主细胞的特性对受体细胞进行筛选或选择。 重组子的筛选 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。 含有重组DNA分子的转化子称为重组子。 如果重组子中含有目的基因，称为阳性克隆子，或期望重组子。 重组子的筛选 重组子的筛选 将转化处理后的受体细胞接种在选择培养基上，培养一定时间，根据菌落生长情况挑选转化子。 在普通培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。 选择物由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，如：抗生素、显色剂。 重组子的筛选 筛选方法主要包括： 1. 抗药性筛选 2. 显色筛选 3. 依据重组子结构特征筛选 抗药性筛选 利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。 氨苄青霉素（Ap或Amp），bla基因可以编码β丙酰胺酶，可降解Ap 氯霉素（Cm或Cmp），cat基因编码氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效 卡那霉素（Km或Kan），Km抗性基因可以转译一种能修饰Km的酶，阻断Km对核糖体的干扰。 抗药性筛选 四环素(Tc或Tet)，Tc抗性基因转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 链霉素(Sm或Str)，Sm抗性基因转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。 抗药性筛选 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛选。 正向选择 插入失活则成为负向选择 培养时间不宜过长，12～16h，转化子菌落会降解药物，导致周围药物浓度降低，长出假转化子菌落。 抗药性筛选 插入失活 外源目的基因插入载体后，抑制筛选标记基因的表达。 插入表达 外源目的基因插入载体后，激活筛选标记基因的表达。 在筛选标记基因前连上一段负调控序列。 显色筛选 原理：如果在载体DNA上组入LacZ’，则重组DNA分子会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到蓝色的转化子菌落。 由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。 营养缺陷型筛选 一些参与核苷酸代谢的基因 酵母载体选择标记基因 培养基 依据重组子结构特征进行筛选 凝胶电泳分析：在转化子筛选的基础上，依据有外源DNA片段的重组质粒与载体DNA之间的大小差别来区分重组子和非重组子。 1. 在平板上挑选菌落 2. 将菌落放入细菌裂解液，悬浮－离心－取上清 3. 电泳 优点：直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。 缺点：载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接 依据重组子结构特征进行筛选 限制性核酸内切酶酶切分析：从转化菌落中挑选菌落，提取质粒，用限制性核酸内切酶进行酶切，然后通过凝胶电泳分析。 优点：可以判断DNA分子插入的方向及分子量的大小。 利用PCR方法筛选重组子 外源DNA两侧序列多数是已知的 通过两侧序列设计引物，扩增 电泳 噬菌斑筛选 对于λDNA系统而言，转导受体菌后，转化子被裂解成噬菌斑，而非转化子则能正常生长，两者很容易区分。 1. 重组λDNA必须在野生型λDNA长度的78~105%范围内才能成功包装。 2. 空载λDNA也能正确包装，可以通过筛选标记基因进行筛选。 筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因经常称为“报告基因”，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达筛选转化细胞。 筛选植物转化细胞 荧光素酶基因（LUC）: LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。 荧光素酶可以在植物细胞内正常表达 优点：检测迅速、灵敏度高、无污染，是一种理想的报告基因。 筛选植物转化细胞 抗除草剂基因 (bar)：bar基因编码的酶能够解除非选择性除草剂的毒性 除草剂是一种谷氨酸类似物，强烈抑制谷胺酰胺合成酶，从而导致植物体内氨的积累，并使植物死亡 bar基因可以将除草剂乙酰化，从而使植物具有除草剂的抗性。 筛选植物转化细胞 葡萄糖酸苷酶（GUS），GUS可以催化人工合成的底物4－甲基伞形花酮，产生一种荧光物质，可用荧光光度计定量测定。 简便快捷、灵敏度高，已被广泛应用与植物基因转化实验，尤其是进行外源基因瞬间表达的系统。 筛选植物转化细胞 氯霉素乙酰转移酶（CAT），可以催化氯霉素失活，因此，与外源DNA共转化的Cat基因能使转基因植物具有抗氯霉素的活性。 哺乳动物转基因细胞的筛选 胸苷激酶基因(TK) 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） 黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT） 这些基因参与核苷酸代谢，缺失后导致营养缺陷。 Thank You * *