杏鲍菇多糖分离纯化及纯度鉴定-张丽霞2015剖析.pptVIP

杏鲍菇多糖的分离、纯化及纯度鉴定 主讲人：张丽霞 教务处 2016.3.4 生物技术综合大实验之三 内容提要 一、多糖纯化的目的与意义 二、材料与设备 三、实验方法步骤 四、实验考核 一、多糖纯化的目的与意义 多糖纯化实质：将粗多糖中的杂质（蛋白质、色素、低聚糖、无机盐）除去而获得分子量和极性均一的多糖组分。 多糖纯品实质：一定分子量范围内的均一组分。 多糖的纯度是研究平菇多糖化学结构与生物活性的基础。 本实验首先采用三氯乙酸法对提取的平菇粗多糖进行脱蛋白，然后利用过氧化氢对其脱色素；再根据多糖所带电荷性质及分子量的不同，采用DEAE-纤维素和Sepharose CL-6B凝胶柱层析相结合的方法，对平菇多糖进行分级纯化，采用旋光法对得到的级分进行纯度鉴定，为后续研究平菇多糖的结构特征和生物活性奠定基础。 以最简单的技术， 最少的步骤， 最高的收率， 最低的成本， 获得纯度样品。 多糖纯化的目的 二、材料与设备 1.材料：已提取的杏鲍菇粗多糖，常规干燥，备用。 2.设备： 低速离心机 、旋转蒸发仪 、自动数显旋光仪、电热恒温水浴锅 、兰格蠕动泵、自动部分收集器、梯度混合器、磁力搅拌器 、电子天平 、电热恒温鼓风干燥箱 、紫外可见分光光度计 、干燥器。 3.试剂 三氯乙酸、30%过氧化氢、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、DEAE - 纤维素、Sepharose CL-6B、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇、95%乙醇。 三、实验方法步骤 1.杏鲍菇多糖的分离纯化流程 杏鲍菇粗多糖?脱蛋白?脱色素?透析?浓缩?冷冻干燥得水溶多糖精品?DEAE-纤维素收集中性多糖组分?Sephade G-100柱层析收集最大组分?透析?浓缩?醇沉过夜?离心?沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤?常规干燥?纯度鉴定?纯多糖。 2.脱蛋白 由于粗多糖中含有一定量游离的和结合的蛋白，为保证多糖的纯度，必须将蛋白质脱去。常用的脱蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法和蛋白酶法（链蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）等。 三氯乙酸法脱蛋白 将粗多糖配成5%的糖液，加入30%三氯乙酸溶液，使三氯乙酸终浓度为15%，在4℃冰箱中放置过夜；离心，弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用1 mol/L NaOH溶液中和至PH为7。 3.脱色 过氧化氢法脱色素 将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水调至pH为8.0，逐滴滴加20%H2O2至溶液为浅黄色，50℃水浴，保温2 h后过滤。 4.透析脱盐 将脱蛋白、脱色后多糖配成5%溶液，置于透析袋中，先用自来水逆向流水透析72 h后，再用蒸馏水透析24 h，每4 h换水一次。 5.干燥 将脱蛋白、脱色、脱盐后的杏鲍菇多糖溶液，水浴80℃浓缩至10 mL, 加三倍体积的无水乙醇过夜，离心取沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得平菇去蛋白除色素多糖。 6. 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量。 （1）测定原理为：游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫酸的作用下，脱水生成糠醛，再与苯酚作用起显色反应，在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。且己糖在490 nm处（戊糖及糖醛酸在480 nm）有最大吸收，故用比色法测定多糖含量。该法简单，快速，灵敏，对每种糖仅需制作一条标准曲线，且颜色持久。 （2）标准曲线的制作：准确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖50 mg定容于500 mL容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL转入试管中，各以蒸馏水补至1.0 mL，每个浓度重复三个平行。然后分别向每支试管中加入6%苯酚试剂0.5 mL及浓硫酸2.5 mL，摇匀，沸水浴中煮沸10 min，冷却至室温，放置10 min后在λ490 nm处测定吸光值A。以吸光值A为纵坐标，糖含量C为横坐标，得糖的标准曲线A = kC。 （3）样品溶液制备：精密称取杏鲍菇多糖5 mg，先加10 mL蒸馏水溶解，然后定容至50 mL。 （4）样品含量测定：用移液管吸取样品液1.0 mL，加入6%苯酚溶液0.5 mL及浓硫酸2.5 mL，按上述方法进行操作，测其吸光值，以标准曲线计算样品糖含量。 7. 分级 通过热水煮提方法提取的多糖，通常是混合物，且分子量不均一，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，可通过柱层析的方法，对其进行分级以达纯化