土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定..docVIP

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定 摘 要：从饭堂门口和生化楼楼下的土壤中分离、纯化、培养获得七个菌株，其中五个为能分泌淀粉的芽孢杆菌，通过一系列生理生化实验，对其中两个菌株的种属进行了初步鉴定，并对其中一株菌所产的淀粉酶活力进行了测定。 关键字：土壤 芽孢杆菌 淀粉酶 鉴定 活力 土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一。 本实验通过小组合作，由老师指导，小组自行设计、进行实验，对土壤微生物进行分离、纯化及鉴定，发酵及产物测定，对学生的实验能力进行一个比较全方面的锻炼和培养。 （1）了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术； （2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法； （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法； （4）培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力； （5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练； （6）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。 1.原理及方法概述 1.1原理 1.1.1芽孢杆菌 1.1.1.1形态学特性：芽孢杆菌细胞呈直杆状，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。 1.1.1.2生理学特性：芽孢杆菌属，革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。多数为腐生菌,主要分布于土壤、动植物体表及水体中。该属细菌的重要生理特性是能够产生对对热、pH和盐各种多样性的不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。） 1.1.2淀粉酶 淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属中能产生淀粉酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值。土壤中可利用的微生物很多，因此从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，能获得有经济价值比较高的菌株。 1.1.4生理生化鉴定 由于各种细菌具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物（如糖、醇及各种含氮物质等）不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不相同，因此可利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。根据《伯杰氏细菌学手册》，在芽孢杆菌属中，我们鉴定用的生理生化实验有：（1）革兰氏染色试验（2）芽孢染色试验(3)淀粉水解试验（4）吲哚试验（5）VP试验（6）细菌糖发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）（7）耐盐试验（8）温度实验（9）PH试验(10)柠檬酸盐利用试验(11)硝酸盐还原试验(12)明胶液化试验(13)酪氨酸水解试验(14)酪素水解试验(15)运动性试验（鞭毛穿刺试验）(16)接触酶试验(17)溶菌酶试验(18)卵磷脂试验 (19) 马尿酸盐实验（不做）（20）苯丙氨酸实验（不做）（21）精氨酸水解实验（不做） 1.2方法 1.2.1分离纯化方法 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。由于芽孢具有较强抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中得到很好的富集。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 1.2.2单染色 用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美蓝、孔