实验一α-淀粉酶酶活的测定讲解.ppt

实验一 α-淀粉酶酶活的测定 GB 8275-2009 食品添加剂 α-淀粉酶制剂 一、实验目的 掌握淀粉酶活力的测定方法； 了解食品添加剂α-淀粉酶制剂的产品标准及检测方法。 二、实验原理 α-淀粉酶alpha-amylase 能水解淀粉分子链中的α-1, 4-葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉粘度迅速下降的酶制剂。 产品分类 按产品的适用温度分为: 中温α-淀粉酶制剂和耐高温α- 淀粉酶制剂。 按产品形态分为： 液体剂型酶制剂和固体剂型酶制剂。 α-淀粉酶制剂的外观要求 固体剂型: 白色至黄褐色固体粉末。无霉变、潮解、结块现象，无异味。易溶于水。 液体剂型: 黄褐色至深褐色液体，无异味，允许有少量凝聚物。 α-淀粉酶制剂的理化要求 α-淀粉酶制剂的卫生要求 酶活测定原理 α-淀粉酶制剂能将淀粉分子链中的α- 1,4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。 酶活定义 中温a一淀粉酶活力： 1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。 耐高温a-淀粉酶活力： 1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，于70℃、pH =6.0条件下，1 min液化 1 mg可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。 三、实验仪器及试剂 仪器： 分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0. 1℃）、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻璃棒、秒表。 试剂及溶液 试剂： 碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）。 溶液配制： 原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液2.00 mL，加20.0 g碘化钾用水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。 试剂及溶液 溶液配制： 可溶性淀粉溶液(20 g/ L)：称取2. 000 g(精确至0. 001 g)可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70 mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒人其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100 mL。溶液现配现用。 磷酸缓冲液(pH=6.0)：称取45. 23 g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和8. 07 g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，用水溶解并定容至1 000 mL。用pH计校正后使用。 盐酸溶液：c ( HCI) = 0. 1 mol/L。 四、实验方法 待测酶液的制备： 称取1 g ~ 2 g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。 注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4 u/mL~4. 5 u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。 酶活力测定 吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min； 立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。 酶活力计算 中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5% 酶活力计算 耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X2 = c×n×16.6