实验四α-淀粉酶的固定化及其酶活测定讲解.ppt

实验四 α-淀粉酶的固定化 及其酶活测定 一、实验目的 掌握凝胶包埋法制备固定化淀粉酶的方法。 了解固定化淀粉酶的应用。 二、实验原理 固定化酶(immobilized enzyme)，是指通过物理或化学法把酶束缚在一定空间内仍具有酶活性的一种酶制剂。 采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。 酶的固定化方法 海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，与一定体积的酶液混合均匀，然后用注射器或滴管将混悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化酶胶粒。 海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化酶的操作简便，条件温和，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，还适合于多种细胞的固定化。 三、仪器和试剂 仪器： 电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布等。 试剂： 海藻酸钠、无水氯化钙、无水磷酸氢二钠、氯化钠、苯甲酸、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、浓盐酸。 四、实验方法 配A液： 取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。 配B液 A液冷却后，将25ml酶液倒入其中，搅匀。 配CaCl2液 取2.2 g无水CaCl2溶于200 ml蒸馏水中。 四、实验方法 制备胶珠： 用注射器（7号针头）将B液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20 min，固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1），并记录。 酶活力测定 吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于烧杯中，加入磷酸缓冲液5 mL，摇匀后，置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热8 min；加入1g固定化酶，立即计时，100r/min条件下准确反应5 min； 立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。 五、酶活力计算 中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制） 。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5% 六、思考题 海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中Ca2+的作用有何区别？ * * *