质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告..docVIP

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280=1.8 DNA纯净 A260/A2801.8 表示蛋白（芳香族）或酚类物质材料与方法一实验材料2×Premix Taq、引物ＤＮＡ10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) Gelview、TBE、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 2. 质粒DNA的提取与制备 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 4.质粒DNA的酶切鉴定 5.琼脂糖凝胶电泳 四、结果与讨论 准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 取0.2?ml?PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入灭菌去离子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl 将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作： 94℃预变性5分钟后开始以下循环 循环为9430 秒，5030 秒，721 分钟。循环为30次 72℃ 5 分钟 4 ℃ 保温 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 13000rpm x 1min，弃上清 加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮 加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮 加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液（500-800μl ） 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液 加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液 向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍操作 空柱13000rpm离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净 空白对照比色测定 向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零 再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据 在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂 无菌水9.0μl、10×M酶切缓冲液 2.0μl、 质粒DNA 7.0μl、 Hind III (15