【2017年整理】枳术汤实验设计.docVIP

2 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 试验动物与试剂药品 1日龄健康海兰灰雏公鸡，购自北京市峪口种鸡场； 鸡新城疫C30-86疫苗（杭州荐量生物工程有限公司，批号：121005）； 免疫因子 (河南森隆兽药有限公司，批号； 鸡新城疫抗原（中国兽医药品监察所，批号：120313）； 一次性血凝板APES（姜堰市新康医疗器械有限公司）； IFN-γ、IL-2试剂盒（均购自美国RD公司）； 磷酸缓冲盐、枸橼酸钠、枸橼酸、乙醇、PBS磷酸缓冲盐等均为国产分析纯试剂； 中草药枳实和白术购于河北省安国市中草药批发市场。 2.1.3 主要仪器设备 MDF-382E直立式超低温冰箱（SANYO Electric Biomedical）； BCD-189型冰箱（青岛海尔股份有限公司）； 移液器（百得实验仪器有限公司）； XSP-C型生物显微镜（重庆广电仪器有限公司）； 酶标仪9602（北京普朗有限公司）； AS200-5型电子天平（OHAUS）； LDZ4-0.8型低速离心机（北京医用离心机厂）； HPX-9162MBE数显电热培养箱（上海博讯实业有限公司）； DHW-600恒温水浴锅（北京国华仪器厂）； KQ-400DB型KQ-400DB（昆山超声仪器有限公司）； MILLI-QRG纯水处理器； YX-280D高压灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂）。 2.2 试验方法 2.2.1 试验动物饲养与分组处理 试验前1周，将饲养工具与周围环境用高锰酸钾与甲醛进行熏蒸5d，然后开窗通风。在雏鸡到之前将室内温度提高到36℃，饲养连续三天后，将室内温度逐渐下降至室温；前3天光照24h，以后每天降一小时逐渐到日常光照；前十天室内湿度为70%左右，饲喂十天后逐渐降至60%；保证充足洁净饮水，采用标准日粮进行饲喂。 将175只1日龄海蓝灰雏鸡随机分为5组，每组35只，7个重复，采用标准日粮进行饲喂。经母源抗体检测后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、四组于10日龄首免鸡新城疫C30-86冻干苗，每只鸡滴鼻点眼2羽份，在10日龄时按照日饲料量的1%(Ⅰ组)、2%（Ⅱ组）饲喂复方中药枳术汤（ZZT），28日龄二次免疫（剂量和方法同首次免疫）。Ⅴ组为空白对照组，不免疫不给药，正常饲养。于17、24、31、38、45日龄时，早晨8点喂料之前进行称重，然后每组分别随机抽取7只鸡，心脏采血，静置两小时后，3000 转/分钟离心10分钟分离血清待用，采集免疫器官并计算免疫器官指数。具体分组及用药见表1。 表1试验分组与用药 Table 1 Animal treatment in different groups 组别 n 给药浓度 给药方式 给药时间 免疫情况 Ⅰ（ZZT）低剂量组 35 1% 拌料 Day 10-45 C30-86冻干苗 Ⅱ（ZZT）高剂量组 35 2% 拌料 Day 10-45 C30-86冻干苗 Ⅲ免疫对照组 35 — — — C30-86冻干苗 Ⅳ“免疫因子”组 35 按说明投药 拌料 Day 10-45 C30-86冻干苗 Ⅴ空白对照组 35 — — — — 2.2.2 生长性能 在每个试验时间点早晨8点喂料之前进行称重，记录每天耗料量。计算平均日增重和料肉比。 平均日增重＝（末重－初重）/天数； 料肉比＝日耗料量/日增重； 2.2.3 免疫器官指数的测定 将各组雏鸡早晨8点开始空腹称重；采集对应的脾脏、法氏囊和胸腺，用滤纸吸去表面水分，然后用分析天平称重、一一记录。根据所称重量计算免疫器官指数。 免疫器官指数=免疫器官重mg/体重g 2.2.4 血清ND抗体水平检测 ⑴ 4单位抗原的配制 在一次性96孔微量血凝板上标号，第一排1-11孔依次向每孔加入PBS液25μL，第12孔加50μL，二三排重复上述操作。再向每排的第1孔加入25μL按标签稀释后的鸡新城疫抗原，吹吸混合均匀，吸25μL至第2孔，吹吸混合均匀，依次同上向后倍比稀释至第11孔，弃去25μL。然后每排的第1-11孔加入PBS液25μL，最后每孔加入1%的鸡红细胞悬液25μL，第1-11孔为试验组，第12孔为红细胞对照孔。将96孔板置于微量振荡器上震动混匀，室温静置40分钟，观察结果。结果判定，96孔板倾斜45°，和对照孔进行比较。倾斜后底部红细胞完全不流动为被新城疫抗原完全凝集，底部红血球呈线性流淌表明红细胞未被或不完全凝集。以100%凝集的抗原最大稀释倍数为该抗原血凝价，即一个凝集单位，从该孔的抗原稀释倍数除以4的稀释倍数，则作为该抗原的4单位抗原。检测血清抗体时对抗原进行二标用以检测抗原配比比例正确。 ⑵ 样品的检测 在一次性96孔微量血凝板上，每排1-11孔依次向每孔加入PBS液25μL，第12孔加50μL，再向每排的第1孔加入25μL待测血清，吹吸混合均匀，依次同上向后倍比