IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的影响研究..docVIP

IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的影响研究 【摘要】目的：探析IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的临床价值。方法：运用嘌呤霉素（PAN）对小鼠足细胞进行刺激，定时定量运用PCR对IQGAP1 mRNA的表达进行检测，运用免疫印迹法对足细胞IQGAP1蛋白的表达进行检测，运用激光共聚焦显微镜对足细胞骨架F-actin分布进行观察，运用F-actin肌动蛋白评分系统（CFS）对骨架重组进行分析，并对上调和下调足细胞IQGAP1表达对PAN诱导足细胞骨架重组的改变进行观察。结果：嘌呤霉素对足细胞进行刺激后，IQGAP1蛋白和mRNA与正常组相比下降明显，比较有统计学意义（P0.05）；足细胞F-actin重组明显；IQGAP1质粒上调明显比较有统计学意义（P0.05）；pCantag-myc-IQGAP1质粒可以对嘌呤霉素诱导的F-actin排列絮乱进行有效抑制，比较有统计学意义（P0.05）。结论：在足细胞细胞骨架重组中，IQGAP1发挥着极其重要的意义。 【关键词】足细胞、细胞骨架、嘌呤霉素、IQGAP1 在肾小球滤过屏障中，足细胞作为其中比较重要的一个组成部分，发挥着极其重要的作用，有学者在相关的研究报道中发现，足细胞往往容易受到不同类型原发性或者继发性肾小球疾病的损伤。近年来，随着现代医学技术水平的不断提高，越来越多肾脏疾病患者被确诊，也有较多的学者开始对足细胞损伤进行研究，并且将肾小球疾病中，临床特点以足细胞损伤为主的划分为足细胞病[1]。一般来说，足细胞出现损伤后，在细胞学上呈现出足突融合、凋亡、停滞发育以及去分化等特点，并且在肾小球疾病中，足突融合是一个比较典型的特点，尤其是微小病变型。有报道显示，在足突融合的过程中，往往容易合并足细胞骨架重组，但是其作用机制尚无统一定论。IQGAP1作为细胞内的一种支架蛋白，可以直接作用于靶分子，从而参与细胞极化、细胞迁移维持、细胞间黏附以及调节细胞骨架重组等一系列病理和生理过程[2]。因此，本文对IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的临床价值进行了探讨，如下报道。 资料和方法 1.1主要试剂 通常情况下，试剂包括胎牛血清、小鼠重组干扰素、IQGAP1抗体、1640胰酶、培养基、异硫氰酸荧光素、近红外800荧光二抗等。 1.2方法 1.2.1培养足细胞 按照常规方法，对永生化小鼠足细胞株进行复苏后，运用含有干扰素10U/ml、胎牛血清10%的1640培养基在5%CO2、33°C的培养箱中进行培养。 1.2.2RT-PCR法对IQGAP1 mRNA表达进行检测 在抽提细胞总RNA时，可以选择Trizol法，在转录合成第1链cDNA时，可以选择M-MuLV逆转录酶，并运用PCR法对IQGAP1 mRNA表达进行定时定量检测。通常情况下，IQGAP1的下游引物和上游引物分别为‘-TCTCGAGAAAGCTGCACAGA-3’、5’-GGGGAAAGGTACCAGTGA-3’，β-actin下游引物和上游引物分别为5’-TAAAGACCTCTATGCCAACA-CAGT-3’、5’-CACGATGGAGGGGCCGACTCATC-3’。运用双标准曲线法对IQGAP1 mRNA表达水平进行分析，其中IQGAP1 mRNA的相对含量运用正常组和嘌呤霉素刺激组的IQGAP1拷贝数比值来进行标示。通常情况下，还需要以下扩增条件，在94°C的条件下，分别进行30s和3min的预变性，并且在72°C条件下预变性30min，53.5°C条件下预变性30s，循环共30个，延伸时间为2min，扩增产物包括Odyssey扫膜和琼脂糖凝胶电泳。 1.2.3运用Western印迹法对IQGAP1蛋白表达进行检测 运用BCA法对蛋白浓度进行测定，在100°C的条件下，进行5min的变形，提取约20μg的上样后，在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，持续电转，直到PVDE膜。在5%（W/V）脱脂奶粉中进行1h的封闭，然后进行稀释处理，一般比例为1:200，在4°C的条件下过夜，运用1×TBST进行3次洗涤，每次洗涤的时间控制在5min左右，将荧光二抗加入其中，在摇床上进行1h的搁置后，在分析蛋白条带吸光度值时，应该采用Gel.Pro Analyzer凝胶定量分析软件，其中参照为β-actin，并且在表示其相对含量时，可以选择β-actin蛋白条带和吸光度比值。 1.2.4FITC-phalloidin染色对F-actin进行标记 采用PBS预冷冲洗细胞爬片，在4°C的条件下，运用4%聚甲醛固定细胞爬片，约30min左右，在4°C的条件下对5mg/L FITC-phalloidin进行避光孵育，对DAPI进行复染，在室温的条件下，进行15min的避光孵育，清晰PBS后，淬灭甘油封片