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转座子标签法 转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的微生物与某一污染物降解菌混合，因转座因子插入到某一降解基因的序列中而破坏了该基因编码的蛋白（酶），导致该菌的降解性能的改变或丧失，进而筛选出转座子插入突变株的方法。 降解菌 转座子(Tn5)突变 降解突变株的选择 从突变株中获得转座子(Tn5)及附近序列 从降解菌中筛选降解基因 在工程菌中表达 转座子标签法 分辨培养大肠杆菌S17-1（含Tn5 转座子）与降解菌 按一定比例混合 过滤，并将滤膜置于LB培养基培养6h 用磷酸缓冲液将膜上的菌冲洗掉，稀释后涂布于选择培养基（含Amp及待降解物）中培养 长出菌落即为Tn5插入变异株 筛选抗药性基因，测定上、下游序列 转座子的遗传学效应 (1) 引起插入突变。 (2) 插入位置上出现新的基因。 (3) 转座子是以它的一个复制品转移到另一位置，而在原来位置上保留原有的转座子。 (4) 改变染色体结构，主要导致染色体缺失、倒位等染色体畸变。 (5) 转座子可以从原来位置上消失，这一过程称为切离。准确的切离使因插入转座子而失活的基因发生回复突变，不准确的切离则不发生回复突变，而是带来染色体畸变。 (6) 调节基因活动的开关。 (7) 产生新的变异，有利于进化。 4. 基因文库的构建 基因文库：生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。 文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。 一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA序列。 细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度 基因工程的操作步骤示意图 目的基因的蛋白产物容易鉴别 目的DNA（或RNA）的纯度要高 目的DNA（或RNA）片段的酶切产物大小合适 注意 * * * * * 1973年，科恩（S.Cohen）等人把两个不同质粒的DNA拼接起来，构成一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系 * 1克胰岛素要从7.5公斤新鲜猪或牛胰脏组织中提取得到，而目前世界上糖尿病患者有6000万人，每人每年约需1克胰岛素，这样总计需从45亿公斤新鲜胰脏中提取。利用基因工程的工程菌生产1克胰岛素，只需20升发酵液 * cDNA：与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。 * 特明Temin与巴尔地磨 (D. Baltimore)?共同荣获1975年的诺贝尔医学及生理学奖。 * 合成cDNA的一般原理 * 10_25_cDNA.jpg * 10_26_Genomic_cDNA.jpg * 玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于9号染色体（20条）上的基因控制的，如控制色素形成的基因C。有C基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有C基因，则表现无色。 但是，在C基因附近，有一个Ds基因（称为解离因子）又控制了C基因的表达或表现。当Ds基因存在时，C基因也不能使籽粒表现有色，即色素不能合成，所以仍然表现无色。 Ds基因如果离开C基因，即从原来位置上断裂或脱落，C基因又重新得以表达，籽粒表现有色。然而，Ds基因能否发生作用，也就是说能否从染色体上解离，又受到第三个基因Ac(称为激活因子)的支配。 Ac基因存在时，Ds基因从染色体上解离，从而解除了它对C基因的抑制，C基因得以表达，籽粒表现有色。Ac不存在时，Ds不解离，C基因受到抑制，不能表达，籽粒表现无色。这就是麦克林托克发现的“Ds Ac调控系统”。 ???在这一系统中，Ds基因与C基因位于同一染色体上的相邻位置，Ac基因与Ds基因却相距很远，甚至不在同一染色体上，但是它却对Ds基因起激活作用。Ds基因解离之后，可以移动位置，它可以离开C基因到达别的地方，也可以重新整合在C基因附近，也就是说它可以“跳动”。???由于Ds基因解离的时间有早有晚、有长有短，表现在籽粒上的色斑就有大有小。换句话说，玉米籽粒（或叶片）之所以出现色斑，以及色斑的大小，既决定于色素基因C的表达，也是由于另外一个或多个基因调节和控制的结果。这是麦克托克在细胞学水平上的对基因的追踪，尽管当时人们还不知道什么是DNA。 * * * * * * 转座子(transposable elements) * * 10_26_Genomic_cDNA.jpg 1970年特明 (H. M. Temin) 等在致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒）中发现了一种特殊的D